日本红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）鳃离子细胞中Kcnj15的基底外侧定位及其在海水—低盐条件下的表达维持

《Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology》：Basolateral localization of Kcnj15 in branchial ionocytes of the seawater pufferfish Takifugu rubripes

　　

海水红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）鳃离子细胞中Kcnj15的基底外侧定位
Kcnj15（Kir4.2）定位于日本红鳍东方鲀Nka（Na⁺/K⁺-ATPase）和Nkcc1a（Na⁺-K⁺-2Cl^?共转运体1a）阳性鳃离子细胞的基底外侧膜。
在海水和低盐条件下，Kcnj15的基底外侧定位得以维持。
鳃kcnj15和nkcc1a mRNA水平随盐度变化无显著改变。
低盐条件下鳃kcnj1a（Kir1.1/Romk）和cftr（囊性纤维化跨膜电导调节因子，Cftr）mRNA水平降低。
Kcnj15可能参与鳃离子细胞基底外侧K⁺漏电导。

研究背景：鳃是硬骨鱼整合渗透压调节、呼吸、酸碱平衡和氮排泄的中心器官。海水硬骨鱼通过饮水以及鳃、肠和肾排出多余离子，以维持体液渗透压约为海水的三分之一。鳃离子细胞（ionocytes，线粒体丰富、承担跨上皮离子转运的上皮细胞）通过基底外侧膜（basolateral membrane，上皮细胞靠近血液/组织液一侧的质膜）上的Nka（Na⁺/K⁺-ATPase，钠钾ATP酶）建立Na⁺梯度，Nkcc1a（Na⁺-K⁺-2Cl^?共转运体1a）累积Cl^?，顶端Cftr（囊性纤维化跨膜电导调节因子，Cl^?通道）介导Cl^?外排，Na⁺主要经细胞旁途径分泌。由于Nka和Nkcc1均将K⁺转入细胞，离子细胞需要导电性K⁺外排途径以稳定细胞内K⁺、膜电位和盐分泌驱动力。已有研究报道鳗鲡Kcnj16（Kir5.1）位于鳃离子细胞基底外侧，罗非鱼Kcnj1位于顶端并介导K⁺排泄，但Kcnj15（Kir4.2，内向整流K⁺通道家族成员）在硬骨鱼鳃离子细胞中的表达、亚细胞定位及盐度调控尚不清楚。日本红鳍东方鲀为广盐性海水鱼，可耐受显著稀释海水；研究人员前期发现Kcnj15表达于其肾、膀胱和肠等渗透压调节器官，且定位随组织和盐度变化，但鳃中是否表达于离子细胞、如何定位及是否响应盐度仍未知，因此开展本研究。

研究人员围绕上述问题，采用实时PCR和免疫组化分析Kcnj15在鳃中的表达与定位，并比较海水、KCl补充海水、1-ppt BW（brackish water，半咸水）和KCl补充1-ppt BW条件下的基因表达。研究得出：Kcnj15定位于Nka阳性和Nkcc1a阳性鳃离子细胞的基底外侧膜，且在海水和低盐条件下定位维持；鳃kcnj15和nkcc1a mRNA水平不随盐度显著变化，而kcnj1a和cftr在低盐下降低。该研究将Kcnj15鉴定为鳃离子细胞基底外侧K⁺漏通路的候选组分，为理解海水鱼鳃离子细胞的分子组织及渗透压适应提供新线索。

关键技术方法：实验鱼为购自当地经销商的日本红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）。实时PCR队列：24–41 g鱼，n=4/条件，自然海水（SW，seawater，35 ppt）或SW+10 mM KCl处理11 d，1-ppt BW或BW+2 mM KCl处理7 d；以actb（β-actin，内参基因）为内参，SYBR Green实时PCR定量kcnj1a、kcnj1b、kcnj15、nkcc1a、nkcc1b、nkcc2、ncc、cftr，采用单因素方差分析及Tukey–Kramer检验。免疫组化队列：300–400 g鱼，SW 22 d或1-ppt BW 13 d；鳃冷冻切片6 μm，用抗Kcnj15兔多克隆抗体、抗Nkcc（T4）小鼠单抗和抗Nka大鼠抗血清行双重免疫染色，共聚焦激光扫描显微镜观察。

研究结果：
3.1 日本红鳍东方鲀鳃中kcnj15及其他离子转运体基因的表达。通过实时PCR在SW、SW-HK、1-ppt BW和BW-HK条件下定量kcnj15、kcnj1a、kcnj1b、nkcc1a、nkcc1b、nkcc2、ncc和cftr mRNA，发现kcnj15在四种条件下均可检出且无显著差异；kcnj1a和cftr在SW及SW-HK下显著高于1-ppt BW及BW-HK；nkcc1a表达较高但组间无显著差异；kcnj1b、nkcc1b、nkcc2和ncc表达很低；同一盐度下KCl补充未见明显变化。结论是kcnj15、nkcc1a、kcnj1a和cftr在鳃中相对高表达，低盐降低kcnj1a和cftr，而不显著改变kcnj15和nkcc1a。
3.2 海水适应日本红鳍东方鲀鳃离子细胞中Kcnj15的基底外侧定位。通过抗Kcnj15抗体免疫组化及抗原吸收血清、预免疫血清等特异性验证，在海水适应鱼鳃上皮细胞中检测到Kcnj15信号；双重染色显示Kcnj15与抗Nkcc（T4）信号及Nka阳性区域明显重叠。结合nkcc1a在鳃中高表达而nkcc1b、nkcc2、ncc很低且缺少ncc2，抗Nkcc（T4）信号主要反映Nkcc1a。结论是Kcnj15定位于海水适应日本红鳍东方鲀鳃离子细胞基底外侧膜。
3.3 低盐条件下日本红鳍东方鲀鳃离子细胞中Kcnj15的基底外侧定位。通过1-ppt BW适应13 d鱼的鳃免疫组化，发现Kcnj15信号仍与抗Nkcc（T4）及Nka信号明显重叠，并保持基底外侧膜定位，与海水适应鱼相比未见明显膜分布差异。结论是Kcnj15的基底外侧定位在低盐条件下维持。

讨论总结：研究人员指出，Kcnj15在硬骨鱼中关注较少；本研究结合特异性抗体和鳃切片免疫组化，证明Kcnj15位于鳃离子细胞基底外侧膜，且表达水平和细胞定位不受环境盐度显著影响，从而将Kcnj15识别为鳃离子细胞分子机器中此前未被认识的组分。基于本研究和其他硬骨鱼资料，研究人员提出海水适应日本红鳍东方鲀离子细胞的离子转运模型：Nka和Nkcc1a位于基底外侧，Cftr和Kcnj1a按其他鱼种资料推定的顶端定位尚待在本鱼种验证；Kcnj15可能贡献基底外侧K⁺漏通路，支持Nka持续活性和膜电位维持；鳗鲡Kcnj16也位于基底外侧，提示多个K⁺通道可能共同参与基底外侧K⁺漏电导。低盐下cftr和kcnj1a表达降低，提示1-ppt BW适应鱼的离子细胞不同于典型海水型主动盐分泌离子细胞，可能需要淡水型离子细胞；日本红鳍东方鲀缺少ncc2，Ncc2依赖的离子摄取途径不太可能存在，Nhe3（Na⁺/H⁺交换体3）型离子细胞可能更重要。研究未检测V-ATPase和顶端离子摄取转运体，未区分丝状和片状离子细胞，也未进行时间进程实验，因此低盐下离子细胞群体和功能异质性尚不能确定。KCl补充在同一盐度下未引起所检基因明显表达变化，与前期肾、肠和膀胱研究一致；但K⁺浓度、暴露时间、采样时间和物种特异性调控阈值均可能影响转录反应，且日本红鳍东方鲀对环境K⁺变化耐受有限，现有数据不足以对Kcnj15等膜转运体在环境K⁺变化中的作用作出确定结论。

研究结论译文：总之，本研究将Kcnj15鉴定为一种K⁺通道蛋白，其在海水和1-ppt BW条件下定位于日本红鳍东方鲀Nka阳性和抗Nkcc（T4）阳性鳃离子细胞的基底外侧膜。同时，低盐下kcnj1a和cftr表达降低，而kcnj15和nkcc1a表达在盐度和KCl条件间无显著差异。这些发现将Kcnj15鉴定为支持离子细胞稳态的基底外侧K⁺漏通路候选组分。尚需功能研究确定其对基底外侧K⁺电导的贡献及其与包括Kcnj16在内的其他K⁺通道的关系。