基于寡核苷酸-金纳米颗粒生物传感器在临床样本中快速可视化直接检测鲍曼不动杆菌及碳青霉烯类耐药性

《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Rapid visual and direct detection of Acinetobacter baumannii and carbapenem resistance by oligoDNA-Gold Nanoparticles biosensor in clinical samples

　　

摘要

鲍曼不动杆菌是医院环境中导致广泛耐药（XDR）感染的主要院内病原体，被世界卫生组织列为关键优先级一级的病原体。然而，临床诊断通常报告为鲍曼-拉乌氏不动杆菌复合体（ACB复合体），包括鲍曼不动杆菌、拉乌氏不动杆菌、院内不动杆菌和皮氏不动杆菌，其中鲍曼不动杆菌是临床意义最大的种。此外，常规诊断方法需要4至48小时，且许多方法需要复杂的基础设施，这凸显了对鲍曼不动杆菌及其碳青霉烯类耐药决定因子进行快速和经济检测的迫切需求。在碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌中，bla_OXA-23和bla_NDM是主要的β-内酰胺酶基因，其中新德里金属β-内酰胺酶（NDM）赋予广谱碳青霉烯类耐药性，严重限制了治疗选择。在本研究中，开发了基于寡聚DNA-金纳米颗粒（AuNP）的生物传感器，用于直接、快速和可视化检测临床呼吸道样本中的鲍曼不动杆菌、bla_OXA-23和bla_NDM，无需DNA纯化或扩增。用于检测鲍曼不动杆菌的生物传感器靶向编码nucAb基因的外膜核酸酶保守区域，从而实现了其准确鉴定。bla_OXA-23生物传感器检测bla_OXA-23基因，这是鲍曼不动杆菌中高度流行的碳青霉烯类耐药基因，而另一种基于bla_NDM基因保守区域的生物传感器不仅检测了鲍曼不动杆菌中的bla_NDM-1，还检测了其在肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌中的变异体。这些生物传感器在30分钟内产生可视化结果，检测限为0.5 ng/μL DNA或103 CFU/mL，以支持早期临床决策，实现优化治疗和抗菌药物耐药性监测。

引言

鲍曼不动杆菌作为多重耐药病原体的出现代表了现代医疗面临日益增长的挑战，这主要由其适应性、环境持久性以及积累多种抗菌药物耐药机制的能力所驱动[1,2]。在COVID-19大流行期间，鲍曼不动杆菌感染的发病率大幅上升，进一步凸显了其临床重要性[3]。由于高发病率和多重耐药性，碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌（CRAB）已被世界卫生组织（WHO）和美国疾病控制与预防中心（CDC）列为关键优先级病原体[4]。

使用常规诊断方法将鲍曼不动杆菌与ACB复合体中的其他成员进行准确区分仍然困难。VITEK 2和API 20NE等自动化表型系统只能在初代培养（过夜生长，18至48小时孵育）后进行运行。由于ACB物种的生化谱重叠，VITEK 2从该复合体中鉴定鲍曼不动杆菌的能力有限[5,6]。MALDI-TOF MS可以改善复合体内的种水平分离，但需要完善的谱数据库、纯培养物、昂贵的仪器和专业技能[34]。常规PCR和qPCR具有敏感性，但通常需要核酸提取和热循环仪。此外，呼吸道样本中的抑制物会降低其性能[7]。等温方法如LAMP具有良好的敏感性，使用更简单的设备，能够耐受临床样本中的抑制物，从而不需要样品制备。然而，它依赖于靶标特异性引物组和多酶，使得检测操作复杂且昂贵[49]。

鲍曼不动杆菌具有多种耐药机制，包括膜通透性降低、外排泵过表达、靶标修饰，以及最重要的β-内酰胺酶的产生[8]。其中，碳青霉烯水解β-内酰胺酶是碳青霉烯类耐药的主要贡献因素[9]。基因组监测显示，大流行相关鲍曼不动杆菌分离株携带bla_OXA-23和bla_NDM-1等耐药基因，促使其快速传播和难以根除[10]。快速准确地鉴定鲍曼不动杆菌及其碳青霉烯类耐药决定因子对于及时的治疗干预和感染控制至关重要。

基于金纳米颗粒（AuNPs）的生物传感器因其独特的光学性质，如局域表面等离子体共振（LSPR），已成为诊断应用中有前景的工具[11]。本研究采用的检测策略基于一种非交联AuNP生物传感器，利用单一寡核苷酸探针，在无特异性DNA靶标时显示酸诱导聚集。这一机制是分析化学中公认的现象，已广泛应用于基于金纳米颗粒的比色生物传感平台进行核酸检测。柠檬酸封端的AuNPs具有带负电的表面，通过静电排斥维持胶体稳定性。当附着在AuNPs上的特异性寡核苷酸探针与互补靶标DNA杂交时，负电荷增加，使纳米颗粒稳定而不易聚集。在缺乏靶标DNA的情况下，加入盐酸会中和AuNPs的表面电荷，减少静电排斥，促进纳米颗粒通过范德华相互作用聚集，产生可见的颜色变化[12]。

基于PCR的方法被广泛用作检测β-内酰胺酶耐药基因的"金标准"，但其对DNA纯化和实验室基础设施的依赖增加了周转时间，并限制了在资源有限地区的部署[13]。基于扩增的方法具有明显优势，但各有局限。多重交叉置换扩增（MCDA）是一种等温方法，对鲍曼不动杆菌和blaOXA-23样基因可达到约100 fg DNA/反应的检测限[14]。它需要10个引物组和一种链置换Bst聚合酶，并在受控温度下进行孵育[15]。重组酶聚合酶扩增（RPA）也是等温的，在低温恒定温度下工作，在15至30分钟内完成，可使用PCR型引物，但需要三种酶：一种重组酶、一种单链DNA结合蛋白和一种链置换聚合酶。LAMP仅需一种聚合酶和四到六个引物，在30分钟内完成，且能耐受临床样本中的抑制物[16]。已有RPA偶联AuNP侧向层析试纸用于检测肠杆菌目中bla_OXA-48和bla_NDM-1的报告[17]。这些生物传感器依赖复杂程序，并使用昂贵仪器进行信号测量和数据分析。此外，其对酶（重组酶和链置换DNA聚合酶）的依赖限制了其在常规诊断中的应用[18]。这些扩增方法的读数通常为侧向层析试纸。试纸可提供简单的可视化结果，无需仪器，已用于MCDA检测鲍曼不动杆菌，以及用于RPA检测肠杆菌目中blaKPC、blaNDM、blaOXA-48样和blaIMP。它需要FITC和生物素标记的引物或探针，以及扩增产物向试纸的转移[51]。已有报道了一种以bla_NDM-1特异性探针功能化的右旋糖衣AuNP生物传感器，可在杂交时实现可视化检测，但需要纯化靶标DNA[19]。然而，大多数方法中核酸扩增的需求、多引物的使用以及扩增后操作增加了程序复杂性和污染风险[20]。在本研究中，与常规方法通常仅检测ACB复合体不同，开发的生物传感器特异性靶向保守的nucAb基因片段，以实现鲍曼不动杆菌的准确种水平鉴定。用于检测主要碳青霉烯类耐药基因bla_OXA-23和bla_NDM-1的生物传感器可直接使用临床呼吸道样本，无需大量处理或DNA扩增即可提供快速可视化结果。在印度，根据ICMR AMRSN 2024年度报告[50]，bla_OXA-23是碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）分离株中主要的获得性碳青霉烯酶，bla_NDM是主要的金属β-内酰胺酶。此外，AuNP-bla_NDM生物传感器靶向bla_NDM基因的保守区域，尽管其序列在包括鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌等多种临床重要病原体中的变异存在多样性，仍可实现跨多个NDM变体的可靠检测。

章节片段

材料

金纳米颗粒（20 nm）购自Sigma-Aldrich。针对nucAb、bla_OXA-23和bla_NDM-1的特异性巯基修饰DNA寡核苷酸由Sigma-Aldrich合成。DTT购自Sigma-Aldrich。NAP5 DNA纯化柱购自Cytiva，英国。本研究中使用的临床分离株和样本来自昌迪加尔Sector 32政府医学院，并在37°C下用Luria Bertani（LB）培养基（Himedia）保存。临床分离株主要为

寡核苷酸设计

NucAb已被证明是一种有前景的疫苗候选物[23]。在本研究中，BLASTn分析显示nucAb基因存在于NCBI上所有可用的鲍曼不动杆菌全基因组序列中（附图1）。设计的基于nucAb基因的25 bp寡核苷酸（表1）在所有50株鲍曼不动杆菌分离株的全基因组中是保守的，与其他不动杆菌物种和ESKAPE组病原体显示出较少的相似性（附表2、3和4）。OXA型β-内酰胺酶

结论

开发的基于金纳米颗粒-寡核苷酸生物传感器可直接从临床样本（如气管吸引液、支气管灌洗液和痰液）中快速可视化检测鲍曼不动杆菌及其碳青霉烯类耐药基因bla_OXA-23和bla_NDM-1，无需基因组DNA纯化或扩增。nucAb生物传感器鉴定了鲍曼不动杆菌，与院内不动杆菌、皮氏不动杆菌和赛氏不动杆菌菌株无交叉反应。bla_NDM-1生物传感器检测该基因不

CRediT作者贡献声明

Anandita Chalana：撰写—原始草稿、方法论、调查研究、正式分析、数据管理、可视化。Varsha Gupta：指导监督、资源提供、撰写—审阅与编辑。Prince Sharma：概念化、撰写—审阅与编辑。Neena Capalash：概念化、指导监督、撰写—审阅与编辑。

利益冲突

作者声明无利益冲突。与此工作相关的印度专利已获授权（专利号543697）。

数据可用性

数据可根据要求提供。

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