靶向真菌鞘脂代谢的下一代广谱抗真菌先导物：N′-(杂芳基亚水杨基)-及N′-(稠合杂双环亚水杨基)-N-芳烃碳酰肼的设计、合成与构效关系研究

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design, Synthesis and SAR Studies of N’-(Heteroarylsalicylidene)- and N’-(Fused-heterobicyclosalicylidene)- N-arenecarbohydrazides as Next-Generation Broad-Spectrum Antifungal Agents

　　

下一代酰腙类（acylhydrazones）化合物表现出强效的广谱抗真菌活性；对世界卫生组织（World Health Organization, WHO）真菌优先病原体清单（Fungal Priority Pathogen List, FPPL）中的真菌病原体具有高度有效性；两个代表性先导化合物在小鼠模型中证实对曲霉病（aspergillosis）具有体内疗效；排名前7位的先导化合物对耳念珠菌（Candida auris, C. auris）主要菌株的全部5株临床分离株均表现出良好活性；排名前7位的先导化合物与氟康唑（fluconazole）和卡泊芬净（caspofungin）表现出强协同作用。

侵袭性真菌感染（invasive fungal infections, IFIs）是全球发病和死亡的重要原因，年度死亡规模与结核病和HIV感染相近；但抗真菌药物储备有限，且多数药物集中于真菌细胞壁相关通路，如麦角固醇生物合成或β-(1,3)-D-葡聚糖合成。WHO发布的首个真菌优先病原体清单（FPPL）将新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）、耳念珠菌（C. auris）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和白念珠菌（Candida albicans）列为“关键优先”病原体，耐药的上升使开发新机制广谱抗真菌药物更为迫切。真菌鞘脂代谢是潜在靶点，葡萄糖神经酰胺（glucosylceramide, GlcCer）对真菌毒力、应激适应和膜组织至关重要，且真菌GlcCer与哺乳动物GlcCer结构差异显著；但真菌鞘脂代谢复杂，通路水平扰动可影响GlcCer、神经酰胺和鞘氨醇等稳态。前期高通量筛选及构效关系（structure-activity relationship, SAR）研究发现N′-亚水杨基-N-芳烃碳酰肼可选择性干扰真菌鞘脂代谢，并在体外和体内显示活性；但部分先导物含多个溴原子，亲脂性（ClogP）较高。以乙炔基生物等排替换溴原子可降低疏水性并保持强效。研究人员据此将N′-亚水杨基部分替换为杂芳基及稠合杂双环体系，设计并合成58个第三代N′-杂芳基亚水杨基-和N′-(稠合杂双环亚水杨基)-N-芳烃碳酰肼，系统考察杂原子组成、空间位阻、构象刚性和柔性等对抗真菌活性及药理性质的影响，并以新型隐球菌、白念珠菌、烟曲霉和耳念珠菌为重点评价广谱活性，进而获得候选先导物，为下一代广谱抗真菌药物开发提供依据。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员通过缩合反应构建58个目标化合物库；以肉汤微量稀释法测定MIC₈₀，菌株包括C. neoformans H99、C. albicans A39、A. fumigatus 293，以及C. auris临床分离株0381、0387、1097、1099、1100；采用时间-杀菌试验测定K₁₀₀；以亮场显微镜和ImageJ定量烟曲霉菌丝长度；以A549人肺癌细胞、HepG2人肝癌细胞及健康人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）评估细胞毒并计算选择性指数（selectivity index, SI）；采用CBA/J雌鼠烟曲霉病模型口服给药30天，评价生存率和肺真菌负荷；以分数抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index, FICI）评价与氟康唑、卡泊芬净的联合作用；采用AutoQSAR进行定量构效关系（quantitative structure-activity relationship, QSAR）分析，pkCSM和Deep-PK预测吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADME/Tox），并以液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行鞘脂组学分析。

研究结果如下。2.1 化学合成：通过芳烃碳酰肼与杂芳基亚水杨醛及稠合杂双环亚水杨醛缩合，合成第三代目标化合物5.0a～5.15d。2.1.1 芳烃碳酰肼的合成：由芳烃甲酸甲酯肼解，或经微波反应及4-烷氧甲基系列修饰制得相应肼。2.1.2 杂芳基亚水杨醛的合成：采用钯催化交叉偶联、Buchwald-Hartwig胺化、甲酰化、Suzuki偶联、铜催化叠氮-炔[3+2]环加成及两步甲酰化制备多种杂芳基和稠合杂双环醛。2.1.3 目标化合物的合成：在冰乙酸催化下于甲醇中缩合，得到目标酰腙，收率55%～98%。2.2 基于真菌药敏的抗真菌活性：以MIC₈₀评价对C. neoformans、C. albicans和A. fumigatus的活性。2.2.1 含吡啶-4-基、吡啶-3-基和嘧啶-5-基的N′-杂芳基亚水杨基-N-芳烃碳酰肼：对C. neoformans活性优良，对C. albicans多数良好，但对A. fumigatus无显著活性，不具广谱性。2.2.2 含吗啉-4-基的类似物：多数对C. neoformans高效，对C. albicans中等，对A. fumigatus无显著活性。2.2.3 含异噁唑-3-基、1-甲基-1H-吡唑-4-基和1H-1,2,3-三唑-4-基的类似物：对C. neoformans优良，对C. albicans中至良好；5.5a对A. fumigatus MIC₈₀为0.5 μg/mL，显示广谱潜力。2.2.3（续）含噻吩-2-基、噻吩-3-基、呋喃-2-基和呋喃-3-基的类似物：对C. neoformans活性极高，10/16个化合物对A. fumigatus有中至良好活性，5.8a达0.01 μg/mL；5.7a、5.8a、5.12a和5.13c对三种病原体MIC₈₀均<1 μg/mL，显示明确广谱活性。2.2.4 含噻唑-4-基、异噻唑-4-基和噻唑-2-基的类似物：对C. neoformans强效，4个化合物对C. albicans优良，6/10个对A. fumigatus有活性；5.9b和5.11b对三种病原体MIC₈₀≤1 μg/mL。2.2.5 含6-羟基-1H-吲唑-7-甲醛稠合杂双环的类似物：对C. neoformans优良，对C. albicans有限，对A. fumigatus无显著活性。2.3 综合SAR分析：绝大多数化合物对C. neoformans的MIC₈₀≤0.25 μg/mL，与B环杂芳基性质关系较小；噻吩、呋喃和噻唑取代物具广谱活性，其中5.9a、5.9b、5.9d、5.11a、5.12a、5.13a、5.13c和5.13d对C. neoformans的MIC₈₀达0.001～0.007 μg/mL；21/58个化合物对C. albicans MIC₈₀≤0.5 μg/mL，5.12a最强（0.06 μg/mL）；仅10/58个对A. fumigatus MIC₈₀<1 μg/mL，且均含硫或氧五元杂芳基；六元杂芳基和1H-吲唑类似物对A. fumigatus无显著活性。2.4 对C. neoformans的时间-杀菌试验：7个最强化合物均具杀菌作用，但动力学不同；5.7a、5.8a、5.13c和5.12a在MIC₈₀低倍数下12～24 h达K₁₀₀，5.9b、5.11b和5.7b需更高浓度和48～72 h。2.5 菌丝形态分析：通过亮场显微镜定量发现5.7a、5.8a和5.12a以浓度依赖方式抑制A. fumigatus菌丝伸长，5.12a在2和8 μg/mL完全抑制。2.6 真菌选择性指数：7个化合物对A549、HepG2和PBMC的SI显示，对C. neoformans SI为1,066～292,571；对C. albicans多数>100；对A. fumigatus SI为16～102,400，5.7a和5.8a对A. fumigatus SI达102,400。2.7 小鼠曲霉病模型体内疗效：5.7a和5.13c口服治疗使生存率分别达70%和80%，SB-AF-1002和伏立康唑分别为50%和60%；30天终点时存活小鼠肺内未检出A. fumigatus；SB-AF-1002药代数据显示相关暴露可维持。2.8 对C. auris的活性：7个化合物对5株C. auris临床分离株MIC₈₀为0.25～4 μg/mL，较氟康唑强8～64倍，较SB-AF-1002和D13强4～32倍；5.11b最有望。2.9 与临床药物联合：7个化合物与氟康唑和卡泊芬净对2株C. auris临床分离株的28个组合中26个协同，2个为无交互，无拮抗；对0387全部协同。2.10 前4个先导化合物：5.7a、5.8a、5.12a和5.13c对C. neoformans、C. albicans、A. fumigatus及多重耐药C. auris均强效，且选择性好、协同明确，被列为进一步临床前开发候选。2.11 QSAR分析：将本研究化合物加入酰腙库，共285个化合物用于AutoQSAR预测C. neoformans MIC₈₀，外部验证在MIC₈₀≤1区间可靠；另建C. albicans（n=84）和A. fumigatus（n=85）模型，回归统计和外验证中等可接受。2.12 ADME/Tox预测：pkCSM和Deep-PK预测所有化合物非致突变、无明显hERG抑制、急性毒性低；多数Caco2通透性中至良好，12/58预测较低；多数预测有肝毒性，但10/58包括5.7a和5.8a预测非肝毒。2.13 鞘脂组学：LC-MS/MS分析C. neoformans经5.7a和5.13c处理后，C26:0-神经酰胺呈剂量依赖降低；4×MIC时羟基化C18:0-GlcCer增加，5.7a还使非羟基化C18:0-GlcCer增加，提示其作用于鞘脂代谢，尤其极长链神经酰胺和特定GlcCer池。

讨论部分总结：研究强调第三代酰腙在保持强效的同时通过杂芳基替换改善性质，获得对WHO关键优先病原体的广谱活性，尤其对多重耐药C. auris优于氟康唑，并与氟康唑和卡泊芬净呈协同或无交互，无拮抗；体内概念验证显示5.7a和5.13c可提高曲霉病小鼠生存并清除肺部感染。讨论也指出，本研究仅在死亡时或30天终点评估真菌负荷，未纳入体内联合队列，5.7a和5.13c自身专门暴露研究尚待开展，后续临床前表征将包括中间时间点采样和与临床抗真菌药联合方案。研究结论部分译为：本研究设计、合成并评价了第三代酰腙类N′-杂芳基亚水杨基-和N′-(稠合亚水杨基)-N-芳烃碳酰肼；该类化合物对C. neoformans具极高效力，52/58个MIC₈₀≤0.25 μg/mL，7个含噻吩、呋喃和噻唑的化合物达0.001～0.007 μg/mL；21/58个对C. albicans MIC₈₀≤0.5 μg/mL，5.12a达0.06 μg/mL；10/58个对A. fumigatus MIC₈₀<1 μg/mL，5.7a和5.8a达0.01 μg/mL；5.7a、5.8a和5.12a浓度依赖抑制菌丝生长；7个最强化合物均对C. neoformans具杀菌作用但动力学不同；选择性总体良好；5.7a和5.13c在小鼠曲霉病模型中生存率分别达70%和80%，30天时肺部感染完全清除；7个化合物对5株C. auris临床分离株均有活性，较氟康唑强8～64倍，并与氟康唑和卡泊芬净呈协同或无交互而无拮抗；QSAR和ADME/Tox预测支持进一步研究；综合结果确定5.7a、5.8a、5.12a和5.13c为最有前景的临床前开发先导物。