四甲基吡嗪通过调节THBS1/PI3K/AKT信号轴并逆转MFN1/FIS1相关线粒体融合-分裂蛋白的异常表达，增强糖尿病后肢缺血的血管生成

《European Journal of Pharmacology》：Tetramethylpyrazine enhances angiogenesis in diabetic hindlimb ischemia by modulating the THBS1/PI3K/AKT signaling axis and reversing aberrant expression of MFN1/FIS1-related mitochondrial fusion-fission proteins

　　## 摘要**[背景]**1型糖尿病下肢缺血（T1DM-HLI）是一种常见的糖尿病微血管并发症，以血管新生受损为特征。四甲基吡嗪（TMP）在血管疾病中显示出治疗潜力，但其在T1DM-HLI中的作用尚不清楚。**[目的]**本研究探讨TMP对T1DM-HLI中血管新生受损的保护作用及其潜在机制。**[方法]**我们评估了TMP对链脲佐菌素诱导的大鼠动脉结扎T1DM-HLI小鼠及高糖处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中血管新生、氧化应激和线粒体融合/分裂平衡的影响。RNA测序鉴定了关键分子机制。分子对接预测了TMP与血小板反应蛋白-1（THBS1）之间的相互作用。我们证明TMP可挽救受损的血管新生和紊乱的线粒体动力学，这些效应可能通过抑制THBS1并激活PI3K/AKT轴介导。**[结果]**TMP恢复了T1DM-HLI小鼠的后肢灌注并促进了血管内皮生长因子A（VEGFA）驱动的血管新生，同时增强了HUVECs的增殖、迁移和管状形成能力。TMP减轻了氧化应激并逆转了线粒体融合和分裂蛋白的异常表达。RNA测序揭示THBS1/PI3K/AKT轴可能在介导TMP的治疗效果中发挥核心作用。分子对接预测了TMP与THBS1之间的潜在相互作用，确定THBS1为TMP的候选靶点。体外和体内实验证实TMP处理减少了THBS1的表达并增加了PI3K和AKT的磷酸化。**[结论]**我们的发现表明，TMP可能通过抑制THBS1并激活PI3K/AKT通路来逆转T1DM-HLI中线粒体融合-分裂蛋白的失调表达并增强血管新生，支持TMP作为糖尿病下肢缺血的治疗候选药物。---## 引言1型糖尿病下肢缺血（T1DM-HLI）是一种严重的糖尿病血管并发症，其发病率与全球糖尿病流行同步上升，已成为糖尿病患者截肢和死亡的主要原因（Xie等，2025）。T1DM-HLI的病理特征是由高血糖微环境诱导的血管新生受损，其特点不仅是动脉粥样硬化性动脉狭窄/阻塞，还包括微循环重塑功能障碍。新生血管不足无法满足缺血肢体的代谢需求，表现为间歇性跛行、皮肤溃疡，并可能导致截肢或死亡（Aday和Matsushita，2021）。与非糖尿病患者相比，糖尿病患者因缺血性血管疾病而面临5-15倍的截肢风险（Thiruvoipati等，2015）。目前的治疗策略——包括血糖控制、抗血小板药物和血管重建——仅能部分减缓疾病进展，约30%的患者治疗效果不佳（Bonaca等，2021）。因此，鉴定低毒性治疗药物并阐明高血糖微环境中的促血管新生靶点对T1DM-HLI的治疗至关重要。血管新生是一个需要多种血管生成因子协调信号的严格调节过程（Gui等，2013）。血小板反应蛋白-1（THBS1）是血管新生和内皮细胞增殖的关键负调节因子（Mohammed等，2022）。THBS1表达升高促进其与分化簇36（CD36）的结合，使THBS1与血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）直接相互作用，诱导VEGFR2去磷酸化并阻断VEGFA驱动的血管新生信号（Ju等，2022）。PI3K/AKT通路构成VEGFA/VEGFR2下游的核心促血管新生信号级联。相反，THBS1下调激活PI3K和AKT磷酸化，促进VEGF诱导的内皮细胞增殖和迁移（Huang等，2025；Liao等，2022）。线粒体功能障碍是高血糖条件下内皮损伤的关键介导因素（Zhang等，2024c）。在1型糖尿病中，暴露于高糖的内皮细胞表现出线粒体碎片化、膜电位丧失、氧化磷酸化受损、ATP产生减少，以及内皮细胞增殖和迁移的相应缺陷。FIS1依赖的线粒体分裂对调节内皮细胞凋亡至关重要（Luo等，2025），而敲低线粒体融合蛋白MFN1/2则抑制VEGF诱导的内皮细胞迁移和毛细血管网络形成（Lugus等，2011）。几项研究表明PI3K/AKT抑制会破坏线粒体分裂/融合动力学（Chen等，2022；Tai等，2021），而线粒体动力学的这种失衡进一步损害血管新生潜力。总之，靶向THBS1/PI3K/AKT信号轴以调节线粒体动力学并增强血管新生可能是T1DM-HLI的一种有希望的治疗策略。川芎是最广泛使用和历史悠久传统中药之一，最早记载于经典药物著作《神农本草经》中。四甲基吡嗪（TMP）是从川芎干燥根茎中分离出的酰胺类生物碱，在血管疾病中显示出相当大的治疗潜力。TMP具有明确的抗炎、抗氧化和改善微循环特性，并已获临床批准用于治疗缺血性卒中和冠心病，其安全性已由充分的临床证据确立（Lin等，2022；Qi等，2024）。近期研究表明，TMP通过靶向表皮生长因子样域7（EGFL7）并上调内皮标志物血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1）促进血管新生（Hao等，2023）。此外，TMP通过维持线粒体动力学和减轻氧化应激来改善脑缺血再灌注损伤中的线粒体异常（Chang等，2023）。然而，这些机制在T1DM-HLI的病理背景下是否起作用仍待研究。因此，本研究旨在确定TMP是否通过靶向THBS1/PI3K/AKT信号轴以调节线粒体动力学来促进T1DM-HLI中的血管新生。---## 片段**试剂**四甲基吡嗪（S27454）和西洛他唑（S50180，纯度>99%）购自上海源叶生物科技有限公司（上海，中国），并溶解于DMSO（ST038）中。链脲佐菌素（S0130）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。抗THBS1（18304-1-AP）、VEGFA（81323-2-RR）、ANG1（68618-1-Ig）、PDGF-BB（83214-5-RR）、VEGFR2（26415-1-AP）、CD31（AFRM0001）、α-SMA（AFMM0002）、FIS1（10956-1-AP）和MFN1（66776-1-Ig）的抗体购自Proteintech集团（武汉，---## TMP促进糖尿病下肢缺血小鼠的血流灌注和血管新生与之前的研究一致，我们通过腹腔注射链脲佐菌素联合股动脉结扎成功建立了T1DM-HLI小鼠模型。然后我们评估了TMP在T1DM-HLI小鼠中的剂量-反应关系。激光散斑对比成像（LSCI）显示，与对照组相比，手术组右后肢灌注显著减少。从给药后第3天开始，TMP和西洛他唑治疗组均表现出增强的血流恢复---## 讨论近年来，糖尿病的患病率在全世界范围内急剧上升，成为一个主要的公共卫生问题。与非糖尿病患者相比，糖尿病患者面临三倍高的外周动脉疾病（PAD）风险（Foussard等，2023）。下肢缺血（HLI）是PAD最常见的表现形式。T1DM-HLI是1型糖尿病的一种严重慢性并发症，其特征是复杂的发病机制，主要涉及内皮细胞---## 结论我们的研究表明，TMP可能通过调节THBS1表达来激活PI3K/AKT信号通路，逆转MFN1/FIS1的异常表达并缓解氧化应激，从而促进T1DM-HLI中的血管新生。这些变化提示线粒体动力学改善。这些发现将TMP定位为T1DM-HLI治疗的有希望候选药物，并表明调节THBS1/PI3K/AKT信号轴代表了一种新的糖尿病缺血性损伤治疗策略。---## CRediT作者贡献声明**姬新云：** 软件，调查。**张宾：** 撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，监督，软件。**张玉燕：** 撰写——审阅与编辑，监督，资金获取。**李思梦：** 项目管理，方法学，数据整理，概念构思。**单楚楚：** 项目管理，方法学，调查，形式分析。**陈兵：** 撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，监督，软件，资源。**潘以锋：** 撰写——审阅与---## 未引用的参考文献Zhang等，2024d。---## 伦理声明本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经浙江中医药大学实验室动物研究中心伦理委员会批准。（批准号IACUC-20240401-20）---## 数据可用性声明数据可从通讯作者处合理要求获取。---## 利益冲突作者声明无利益冲突。---## 伦理批准和同意参与：所有动物操作均经浙江中医药大学实验室动物研究中心伦理委员会批准（IACUC批准号IACUC-20240401-20）。所有动物实验方案均符合美国国立卫生研究院发布的《实验室动物照顾和使用指南》。---## 资金支持本研究得到浙江省科技计划中医药项目（编号2023ZF059, 2026ZF087）和浙江中医药大学科研项目的支持（编号2025JKZDZC09）。---## 利益冲突声明? 作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。---## 致谢作者感谢所有实验室成员的帮助。我们也感谢BioRender（https://www.biorender.com/）提供插图工具。---潘以锋|李思梦|单楚楚|宋静美|俞泽斌|石瑞|叶长义|姬新云|张宾|张玉燕|陈兵