基于可逆 i-motif 切换和 FRET 的双模式荧光传感平台用于可靠的 pH 检测

《Food Chemistry》：A dual-mode fluorescence sensing platform based on reversible i-motif switching and FRET for reliable pH detection

　　

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  开发了一种基于FRET偶联的i-motif双模式荧光传感策略。
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  实现了互补的开启和关闭荧光响应。
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  应用于食品储存期间的pH监测和尿素酶活性的间接检测。
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  互补的荧光输出为pH相关信号的交叉验证提供了基础。

引言

快速、便捷的pH分析需求在从食品质量控制到生物医学诊断的各个领域受到了广泛关注。在鱼类和肉类等富含蛋白质的食品中，储存过程中微生物的生长和内生酶反应会逐渐降解蛋白质和氨基酸。该过程产生挥发性碱性化合物，包括氨和各种胺，从而导致pH逐渐升高（Mu等，2022）。由于这种与腐败的密切关系，pH通常被用作与蛋白质类食品新鲜度变化相关的指标。传统的pH测量通常使用电极或基于仪器的分析方法进行。尽管可靠，但这些方法通常需要多个操作步骤，不太适合快速现场监测（Liu等，2022）。pH的变化也与许多生物过程密切相关。例如，尿素酶催化尿素水解为氨，导致周围微环境变得更加碱性（Erfkamp等，2019；Jannah和Kim，2019）。该酶被认为是几种致病细菌的重要毒力因子，包括幽门螺杆菌，其活性与胃溃疡和胃癌有关（Albrich等，2024）。因此，pH变化经常被用作监测酶活性和构建生物传感平台的间接分析信号（An等，2022）。这些应用凸显了开发能够在不同分析场景中工作的pH响应传感系统的价值。

在近年来探索的传感元件中，核酸结构响应系统因其可编程性、生物相容性和易于修饰而成为有吸引力的候选对象（Zheng等，2021）。一个典型的例子是i-motif，一种由富含胞嘧啶的序列形成的四链DNA二级结构。在酸性条件下（通常pH ≤ 6.0），质子化的胞嘧啶残基通过半质子化C·C⁺碱基配对稳定折叠结构。当pH向中性或弱碱性条件转变时（通常pH ≥ 6.5），这些相互作用减弱，结构展开为无序的单链构象（Abdelhamid等，2019；Devaux等，2020）。由于这种结构转变直接受质子浓度控制，i-motif可以有效地将环境pH变化转化为可测量的构象信号。这一特性使其在pH响应生物传感器、核酸纳米器件和其他可控分子系统中得到应用（Chan等，2024；Turaev等，2021）。

荧光共振能量转移（FRET）提供了一种将此类结构变化转换为光学输出的有用手段。作为一种距离依赖的能量转移过程，FRET通过供体和受体荧光团之间的偶极-偶极相互作用发生（Sahoo，2011）。其效率对纳米尺度的距离变化高度敏感，通常在1-10 nm范围内，并遵循与供体-受体分离度的逆六次方关系（Kaur等，2020；Ling等，2020）。当两个分子位置靠近时，供体的荧光被有效猝灭。增加分离距离会减弱能量转移并恢复荧光发射（Ha等，2024）。由于核酸构象变化可以直接改变供体-受体间距，FRET已成为探测分子动力学和设计荧光生物传感器的广泛使用工具（Kudlacek等，2008）。因此，将FRET与i-motif的pH依赖性折叠行为结合为pH响应荧光传感提供了一条直接途径。

尽管有这些优势，许多已报道的i-motif传感平台仅通过单一荧光响应途径运作，在供体-受体距离变化时产生信号增强或信号猝灭（H?fig等，2018）。然而在实际应用中，分析性能可能受到样品复杂性的影响。离子强度、环境pH或背景自荧光的变化可能会改变信号强度并降低测量可靠性（Verma等，2023）。单一荧光输出可能提供的有限信息，难以将预期的pH响应与其他信号变化来源区分开来（Gest等，2024；Zhang等，2026）。产生互补的荧光输出可能提供了一种额外的方法来检查不同传感模式下的响应一致性。然而，这种互补读出是否始终能提高分析可靠性，取决于其响应特征和在有样品基质中的性能，需要实验验证。

在本工作中，通过整合i-motif结构开关与FRET调控，建立了一种pH响应荧光传感平台。通过合理排列荧光团Cy3和猝灭剂BHQ2，并引入互补链（cDNA-BHQ2），构建了两种传感格式：单链探针（SS探针，Cy3-i-motif-BHQ2）和双链探针系统（DS探针，Cy3-i-motif/cDNA-BHQ2）。随着环境pH从酸性（pH ≤ 6.0）增加到中性或弱碱性条件（pH ≥ 6.5），两个系统表现出相反的荧光行为。SS探针通过pH诱导的FRET效率调节产生荧光开启响应，而DS探针产生由pH触发的杂交和供体-受体重组驱动的关闭响应。这些不同的信号输出为pH依赖性i-motif开关提供了互补读出，并为交叉验证两种传感模式获得的响应提供了基础。该平台被用于监测鲈鱼和羊肉末储存过程中的pH变化以及通过酶诱导的pH变化间接检测尿素酶活性。本研究探讨了互补荧光响应支持更可靠pH分析的潜力，同时需要进一步验证以确立在复杂样品基质中交叉检查的有效性。

部分摘要

实验部分

所有实验部分的详细信息请参阅支持信息。除非另有说明，所有实验均独立进行三次重复。数据以均值±标准差表示。

构建i-motif驱动的双模式荧光传感策略用于pH响应检测

通过利用i-motif DNA可逆的pH依赖性结构转变，构建了一个具有内置交叉验证机制的双模式荧光传感平台。i-motif在酸性条件（pH ≤ 6.0）下通过半质子化C·C⁺碱基配对由富含胞嘧啶的序列形成，产生紧密的四链结构。随着pH向中性或弱碱性条件转变（pH ≥ 6.5），质子化逐渐丧失，C·C⁺相互作用变得

结论

通过将i-motif DNA的可逆结构转变与荧光共振能量转移偶联，构建了一个双模式荧光传感平台。两种探针构型被整合到一个系统中。单链探针产生荧光增强，而双链探针产生猝灭响应。这些相反的响应源自相同的pH触发i-motif结构开关，但涉及不同的信号转导途径，

CRediT作者贡献声明

Shiqi Yang：撰写-审阅与编辑、可视化、验证、方法论、调查、形式分析、数据整理、概念构思。Zimeng Li：验证、方法论、调查、形式分析。Xi Wang：调查、概念构思。Jie Sheng：调查、数据整理。Xiaojun Bian：数据整理、概念构思。Donglei Luan：监督、方法论、概念构思。Juan Yan：撰写-审阅与编辑、可视化、监督、资源、项目

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作获得IRCFH开放基金（A1-2007-26-000704）、山东省重点研发计划（2023CXPT050）、国家自然科学基金委员会（编号：21775102）和上海自然科学基金委员会（编号：20ZR1424100）的资助。

Shiqi Yang|Zimeng Li|Xi Wang|Jie Sheng|Xiaojun Bian|Donglei Luan|Juan Yan