《IBRO Neuroscience Reports》：Xanthohumol promotes cognitive function-associated neuroprotein changes in two mouse models of Alzheimer’s disease
编辑推荐：
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性损害认知功能的神经退行性疾病，目前尚无有效治疗方法。天然膳食化合物如黄腐酚（xanthohumol, Xn）可能为AD提供新的治疗途径。本研究旨在采用定量蛋白质组学技术，探究Xn对两种已
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性损害认知功能的神经退行性疾病，目前尚无有效治疗方法。天然膳食化合物如黄腐酚（xanthohumol, Xn）可能为AD提供新的治疗途径。本研究旨在采用定量蛋白质组学技术，探究Xn对两种已建立的AD小鼠模型中认知损伤的影响。使用0.5 mg/kg Xn处理可显著提升3×Tg AD小鼠的学习记忆与认知功能，而5 mg/kg Xn则可改善APP/PS1小鼠的认知衰退。研究人员在3×Tg AD小鼠海马中鉴定出2种共同差异蛋白及12条信号通路，在APP/PS1小鼠中鉴定出70种共同差异蛋白及22条信号通路。此外，发现9条共同信号通路主要涉及能量代谢、神经退行性疾病、心血管疾病与癌症。因此，多高通量海马蛋白质组学分析为开发有效的AD药物（其中Xn为候选药物之一）增添了科学依据。
研究背景与目的
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种起病隐匿、呈进行性发展的慢性神经退行性疾病，临床最常见于老年期。AD约占痴呆病例的60%-70%，是全球十大死因之一，给患者、照护者、家庭乃至整个社会带来巨大的身心、社会与经济负担。然而，AD的病因与发病机制尚不明确，目前缺乏能够延缓或阻止脑部疾病临床病程的有效治疗方法。
黄腐酚（xanthohumol, Xn）来源于啤酒花（Humulus lupulus L.）雌花提取物，啤酒花是一种药食同源植物，也是酿造啤酒的主要原料之一。既往研究显示，Xn在代谢综合征、骨关节炎、糖尿病肾病及癌症等多种健康紊乱中具有生物学效应。在实验研究中，Xn可显著减轻APP/PS1小鼠的记忆障碍、老年大脑的炎症与凋亡、改善载脂蛋白E（ApoE）亚型依赖的认知表现，并抑制tau蛋白聚集和解聚tau原纤维。更重要的是，两种Xn衍生物（Xn-3和Xn-9）被发现具有血脑屏障通透性和神经保护作用。研究人员的先前工作表明，Xn通过淀粉样前体蛋白（APP）加工和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）通路显著抑制N2a/APP细胞中的β-淀粉样蛋白（Aβ）产生和tau过度磷酸化。此外，Xn还能降低年轻和年老APP/PS1小鼠的认知功能障碍并显著调节肠道微生物群的多样性。这些数据提示Xn可能是治疗AD的有前景的候选药物，但其在AD动物模型中的具体保护机制仍不清楚。
基于此，本研究利用两种已建立的AD小鼠模型（3×Tg AD小鼠和APP/PS1小鼠），结合两种蛋白质组学技术——二维差异凝胶电泳（two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE）串联质谱（MALDI-TOF-MS/MS）与串联质量标签（tandem mass tag, TMT）标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），系统探究Xn对认知功能的影响及其背后的分子机制。
主要关键技术方法
研究人员采用了两种互补的蛋白质组学技术：对于3×Tg AD小鼠，使用2D-DIGE结合MALDI-TOF-MS/MS进行海马蛋白质组分析；对于APP/PS1小鼠，则使用TMT标记结合纳升液相色谱（Nano-LC）-LC-MS/MS技术。行为学测试包括避暗实验（step-down passive avoidance, SPA）和Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）实验。所有动物均来自深圳疾病预防控制中心伦理委员会批准的实验方案（批准号：2019034、2022019）。
研究结果
3.1 Xn显著缓解3×Tg AD小鼠的认知损伤
SPA测试结果显示，与野生型（wild-type, WT）小鼠相比，3×Tg AD小鼠的跳台潜伏期（step down latency, SDL）显著缩短，错误次数（error times, ET）显著增加，符合记忆损伤特征。0.5 mg/kg Xn处理显著改善了3×Tg AD小鼠的学习记忆能力（潜伏期t=144.5, P=0.0072；错误次数t=-1.6, P=0.0029）。MWM测试表明，随着训练天数增加，各组小鼠找到平台的时间逐渐缩短，但组间无统计学差异。与未处理3×Tg AD小鼠相比，Xn处理组小鼠的目标象限运动轨迹更集中，穿越平台次数显著增加（t=3.2, P=0.0023），探索平台时间显著减少（t=-29.9, P=0.014），目标象限的活动距离和时间百分比也显著增加。综上，3×Tg AD小鼠表现出明显的学习记忆损伤，而Xn处理可显著缓解这一损伤。
3.2 Xn改善APP/PS1小鼠的学习与记忆能力
MWM测试评估了APP/PS1小鼠的学习记忆能力。与未处理的APP/PS1小鼠相比，Xn处理组表现更好。在5天训练期内，所有小鼠找到隐藏平台的时间均逐渐缩短（Ftotal=2.893, P=0.0444），其中Xn处理和未处理的WT小鼠领先。此外，Xn处理小鼠比未处理小鼠耗时更少，雌性APP/PS1小鼠比雄性更为明显（F=5.122, P=0.0022）。在探查期，与APP/PS1组相比，Xn处理小鼠穿越平台区域的次数更多，在目标象限停留的时间和距离更长（t=8.681, P=0.0478；t=9.198, P=0.0217）。这些结果表明Xn处理改善了APP/PS1小鼠的认知衰退。
3.3 Xn改变3×Tg AD小鼠海马蛋白表达水平
选取行为学结果差异显著的三个组进行蛋白质分析。与WT小鼠相比，3×Tg AD小鼠中共有30个海马蛋白具有统计学差异，其中19个低表达、11个高表达。与3×Tg AD对照组相比，Xn处理后共有27个蛋白具有统计学差异，包括11个低表达和16个高表达蛋白。这些差异蛋白主要涉及氧化应激、线粒体呼吸与能量代谢、突触、细胞骨架、分子伴侣等。有趣的是，在两个比较组中发现两个共同差异蛋白：一个是线粒体异柠檬酸脱氢酶[NAD]亚基α（IDH3A），在3×Tg AD小鼠中较WT小鼠降低，但在0.5 mg/kg Xn处理后相对升高；另一个是蛋白-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸)O-甲基转移酶，表达下调。
基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示，Xn处理增加了三个细胞组分（胞外外泌体、髓鞘和线粒体），降低了分子功能中泛素蛋白连接酶结合能力。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析发现，3×Tg AD与WT小鼠比较中有19条有意义通路，Xn处理组与3×Tg AD对照组比较中有14条通路，两者共有12条共同通路，其中IDH3A参与代谢通路、碳代谢、柠檬酸循环（TCA循环）和2-氧代羧酸代谢四条通路。
3.4 Xn改变APP/PS1小鼠海马蛋白表达水平
采用TMT定量蛋白质组学策略分析Xn处理的APP/PS1小鼠差异蛋白。APP/PS1与WT小鼠比较共检测到407个差异海马蛋白，其中227个高表达、180个低表达。APP/PS1小鼠经5 mg/kg Xn处理与未处理APP/PS1小鼠比较共发现421个差异蛋白，其中285个高表达、136个低表达。进一步发现70个共同差异蛋白，其中39个上调、25个下调、6个保持不变。这些共同蛋白主要涉及结合、催化活性、分子功能调节活性、结构分子活性、转运活性、转录调节活性等生物学功能。
DAVID和GO注释分析按生物学过程（biological process, BP）、细胞组分（cellular component, CC）和分子功能（molecular function, MF）进行分类和富集。BP主要富集于蛋白运输、细胞周期、细胞分裂、细胞内蛋白运输、离子运输等；CC主要富集于细胞质、膜、细胞骨架、胞质溶胶、质膜、线粒体、核质等；MF主要富集于蛋白结合、相同蛋白结合、核苷酸结合、大分子复合物结合、ATP结合等。KEGG通路分析发现，APP/PS1与WT小鼠比较中有42条显著通路，APP/PS1小鼠经5 mg/kg Xn处理与未处理组比较中有46条显著通路，两者共有22条共同通路，其中蛋白富集较多的通路包括代谢通路、多疾病神经退行性变通路、阿尔茨海默病等。值得注意的是，线粒体细胞色素c氧化酶亚基6A1、线粒体ATP合酶F(0)复合物亚基B1、NADH脱氢酶[泛醌]1亚基C2和NADH脱氢酶[泛醌]1β亚复合物亚基4至少参与了其中10条共同通路。
3.5 Xn处理后AD模型小鼠海马蛋白质组学的综合分析
通过比较两种不同处理方法（2D-DIGE MALDI-TOF MS/MS与TMT标记LC-MS/MS技术）的蛋白质组学结果，发现9条共同信号通路，主要涉及全局代谢、能量代谢、神经退行性疾病、心血管疾病和癌症，具体包括：代谢通路、多疾病神经退行性变通路、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、朊病毒病、糖尿病心肌病、化学致癌-活性氧以及氧化磷酸化。
讨论与结论
研究表明，系统性Xn处理显著改善了两种转基因AD小鼠模型的认知功能障碍。0.5 mg/kg Xn每日腹腔注射6周可改善3×Tg AD小鼠的认知功能，5 mg/kg Xn隔日灌胃3个月可改善APP/PS1小鼠的认知衰退。这与研究人员先前的研究结果一致。
通过蛋白质组学分析，研究人员在Xn处理后的AD小鼠海马中鉴定了分子变化。2D-DIGE是唯一应用内标的蛋白质组学方法，可最大限度减少系统误差；TMT则适合同时分析多个样本的剂量依赖性、时间过程和生物学重复。TMT相较于2D-DIGE具有提高相对定量数量、增加样本通量和减少缺失定量信息的优势。Xn处理后，TMT在APP/PS1小鼠中鉴定出421个差异蛋白，而2D-DIGE在3×Tg AD小鼠中仅发现27个差异蛋白，数量相差约15-16倍，但两种组学方法之间未发现共同差异蛋白。
研究发现9条共同信号通路，为理解Xn缓解AD认知损伤的分子机制提供了线索。系统性Xn处理通过调节代谢通路和负责生成三磷酸腺苷（ATP）的氧化磷酸化通路，减轻了两种AD小鼠的认知损伤。大脑持续的高ATP需求使其对能量供应和线粒体功能的变化敏感，生物能量缺陷和慢性氧化应激均是AD的重要诱因。研究人员此前发现Xn可通过调节氧化应激等多条致病通路减少N2a/APP细胞中的AD相关变化，因此促进脑生物能量学可能是Xn在AD细胞和动物模型中发挥治疗作用的重要组成部分。
此外，AD与糖尿病、心血管疾病和癌症之间的关联在本研究的蛋白质组学结果中也得到体现。代谢通路和糖尿病心肌病通路出现在两种AD小鼠模型经Xn处理后的差异信号通路中。心血管疾病不仅与AD进展相关，还是AD的风险因素和潜在预测因子。流行病学研究显示癌症与AD之间存在负相关关系。
尽管本研究识别了Xn改善AD小鼠认知衰退的潜在蛋白标志物和KEGG通路，但也存在一些不足：两种AD模型小鼠类型、Xn给药途径和蛋白质组学分析技术各不相同；海马蛋白质组学分析仅针对行为学结果明确的组别进行；筛选的蛋白标志物或关键信号通路未进一步验证；除行为学数据外，未展示更多AD相关特征指标如老年斑和Tau蛋白；研究未设计剂量-反应关系测试。不过，Xn处理在无明显不良反应的情况下似乎减缓了认知衰退进程。此外，MWM测试的一个意外发现是，Xn似乎加速了正常（WT）年轻成年小鼠的记忆获取速度，若在后续研究中得到证实，可能表明Xn在认知发育和认知衰退两方面均有作用。
结论：基于两种AD小鼠模型配对行为学研究中Xn处理的积极认知结果，研究人员比较了两种蛋白质组学技术，以鉴定脑海马中的潜在蛋白靶点和信号通路。这些结果为理解Xn在小鼠中的神经保护作用的分子机制提供了新见解，并为这种天然的、源自啤酒花的异戊烯基查尔酮作为食品添加剂或药物研发（主要针对AD）提供了依据。
