《Industrial Crops and Products》：Systematic characterization of endogenous and heterologous promoters establishes a modular expression toolkit for
Salvia miltiorrhiza
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本研究对丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根中的16种启动子进行了系统性基准测试。研究人员发现PSmPR10、PMAS和PMinSyn110在毛状根中表现出强活性。所选活性区域PSmPR10–2在不同终止子背景下均保持高活性。内源性启动子在再生
本研究对丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根中的16种启动子进行了系统性基准测试。研究人员发现PSmPR10、PMAS和PMinSyn110在毛状根中表现出强活性。所选活性区域PSmPR10–2在不同终止子背景下均保持高活性。内源性启动子在再生植株中实现了组织偏好性表达。这些发现为丹参合成生物学建立了结构化的启动子资源库，涵盖强组成型启动子、具有不同组织活性特征的内源启动子、保留显著活性的紧凑启动子片段以及不同兼容性特征的启动子-终止子组合，从而实现对基因表达的精准灵活调控。
研究背景与现存问题
植物合成生物学日益依赖于经过充分表征的调控元件，以实现跨组织、发育阶段及代谢途径模块的转基因表达调控。药用植物天然产物的代谢工程通常需要协调优化途径基因表达、酶活性及前体与辅因子供应。过高或过低活性的启动子可能导致代谢瓶颈、前体浪费或增加宿主负担。此外，重复使用相同的强组成型启动子可能增加转基因沉默的风险，并损害多基因电路的长期稳定性。相比之下，组织偏好性、诱导型及内源性组成型启动子能够提供更高分辨率的代谢流分布控制。在药用植物中，这种精确调控的需求尤为关键，因为目标次生代谢产物往往表现出显著的器官特异性、发育阶段依赖性及诱导响应模式。
丹参（Salvia miltiorrhiza）是中国广泛种植的重要药用植物，也是阐明植物天然产物生物合成及调控网络的代表性模型系统。其根部积累脂溶性丹参酮和水溶性酚酸两类活性化合物。近年来，围绕这两类化合物的生物合成、激素调控、转录因子网络及表观遗传修饰机制已建立起较为系统的研究基础。同时，丹参毛状根具有激素非依赖快速生长、遗传特性相对稳定、代谢能力强、适合液体培养规模化等优势，已被广泛应用于次生代谢研究与代谢工程。然而，丹参底盘系统中调控元件的开发明显滞后于代谢通路研究与转化技术的进展。与烟草等已有定量启动子-终止子组合基准测试的系统相比，丹参当前的研究仍主要集中在转录因子功能鉴定、激素响应分析及靶向通路调控机制探究。常用的强启动子如CaMV35S被普遍用于过表达、亚细胞定位及功能验证，但缺乏对内源性启动子的系统性挖掘、统一报告系统下的横向比较以及启动子-终止子组合效应的评估。因此，对于丹参这类具有明显器官偏好性代谢特征的药用植物，建立包含内源性启动子、常用异源启动子、短启动子片段及高性能终止子组合的综合工具包具有重要的方法论意义。
研究内容与结论
研究人员从丹参毛状根转录组数据中筛选了8个高表达基因的上游约2 kb区域作为候选内源启动子，并与8个来自病毒、植物及人工合成的异源组成型启动子进行比较。利用RUBY报告基因（甜菜红素可视化报告系统）在统一载体背景下评估所有启动子的活性。通过本氏烟（Nicotiana benthamiana）瞬时表达和丹参毛状根稳定转化体系进行活性检测，并对高活性内源启动子进行截短分析和顺式元件预测。进一步选取两个截短启动子与7种不同终止子组合测试，最后将转基因毛状根再生为完整植株评估组织活性。研究得出以下结论：PSmPR10、PMAS和PMinSyn110在丹参毛状根中表现出最强活性，显著高于PCaMV35S；截短后的PSmPR10–2保留了全长启动子的高活性；PSmPR10–2在多种终止子背景下维持稳定活性，而PSmUBQ-1对终止子更敏感；在再生植株中，PSmMLP31和PSmMT1表现为根偏好性启动子，PSmDNAJ为叶偏好性启动子，PSmPR10–2为茎偏好性启动子且活性最强。
关键技术方法
研究人员采用了转录组引导的候选启动子筛选策略，从3份独立野生型丹参毛状根样本的转录组数据中，依据平均TPM值排名选择8个高表达基因（排名第8至第60位）作为内源启动子来源。利用RUBY报告基因系统实现启动子活性的可视化定性和定量检测。通过本氏烟叶片瞬时表达体系进行初步功能筛选，随后采用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC15834介导的丹参毛状根稳定转化体系进行最终验证。利用PlantCARE数据库进行顺式调控元件预测，结合BDGP程序预测核心启动子区域指导截短设计。最后通过激素介导的组织培养将转基因毛状根再生为完整丹参植株，评估组织特异性活性。
研究结果
3.1 转录组引导的启动子挖掘识别具有不同组织表达模式的内源候选启动子：通过转录组引导筛选，研究人员从丹参毛状根中鉴定了8个候选内源启动子基因（SmKIR、SmPR10、SmCAT、SmMT1、SmMLP31、SmUBQ、SmDNAJ、SmEXT）。表达谱分析显示，SmMT1、SmEXT、SmMLP31和SmKIR在根或毛状根中活性较高；SmPR10和SmCAT在地上部分（茎和叶）表达更强；SmUBQ在毛状根中最活跃；SmDNAJ在各组织中表达相对均匀。
3.2 RUBY报告平台实现内源与组成型启动子的比较：研究人员构建了启动子-RUBY报告载体，将8个内源启动子与8个组成型启动子（PCaMV35S、PNOS、PAtUBQ10、PMAS、PMinSyn105、PMinSyn108、PMinSyn110、PSlRBCS2）在同一报告背景下进行比较。
3.3 候选启动子在烟草瞬时实验中呈现不同活性范围：在本氏烟叶片瞬时表达中，16个启动子均驱动了不同程度的RUBY色素积累。仅PMinSyn110驱动的甜菜红素积累显著高于PCaMV35S。另有9个启动子（PAtUBQ10、PMAS、PMinSyn105、PMinSyn108、PSlRBCS2、PSmKIR、PSmPR10、PSmUBQ、PSmEXT）产生的甜菜红素水平与PCaMV35S相当或略高。
3.4 启动子在丹参毛状根中的活性揭示强组成型和内源调控元件：在丹参毛状根稳定转化体系中，PSmPR10、PMAS和PMinSyn110产生显著高于PCaMV35S的甜菜红素含量。PAtUBQ10、PMinSyn105、PSmUBQ和PSmEXT的活性与PCaMV35S相当或略高，其余启动子活性较低。这一结果与烟草瞬时实验基本一致。
3.5 顺式元件分析与截短分析确定紧凑的内源启动子片段：研究人员对四个高活性内源启动子（PSmUBQ、PSmEXT、PSmKIR、PSmPR10）进行截短分析。五个截短片段中，PSmUBQ-1、PSmEXT-1、PSmKIR-1和PSmPR10–2保留了与全长启动子相似的活性，而PSmPR10–1活性显著降低。在丹参毛状根中，PSmPR10–2表现出最高活性，其次是PSmUBQ-1。
3.6 终止子配对揭示启动子依赖的调控兼容性：PSmUBQ-1与7种终止子组合后在烟草中表现相对一致的活性水平。PSmPR10–2在毛状根中对多数终止子保持强活性，显示广泛的兼容性。而PSmUBQ-1对终止子较敏感，与Tags组合时活性显著降低。
3.7 高活性启动子在再生的转基因丹参植株中保持功能：在再生植株中，PSmMLP31和PSmMT1表现为根偏好性启动子，PSmDNAJ为叶偏好性启动子，PSmPR10–2为茎偏好性启动子且活性最强（达到1.361 mg/100 ml茎和1.000 mg/100 ml根）。
讨论与结论
研究表明，启动子性能在不同植物底盘间差异显著，底盘特异性验证至关重要。PMAS和PMinSyn110在丹参毛状根中表现出强活性，证明异源组成型启动子在该系统中的潜在应用价值。值得注意的是，PSmPR10在丹参毛状根中的转录活性显著强于所有测试的异源组成型启动子，表明内源调控元件可以扩展标准组成型启动子所提供的表达范围。截短分析表明，强转录所需的调控信息可能集中分布在特定启动子区域，紧凑启动子片段可减少载体尺寸同时保持活性。启动子-终止子配对实验进一步证明下游调控元件可以启动子依赖的方式调节靶基因表达，这种差异兼容性为模块化途径组装提供了额外的精细调控手段。结论：本研究为丹参合成生物学建立了结构化的启动子资源库，包括强组成型启动子、具有不同组织活性特征的内源启动子、保留显著活性的紧凑启动子片段以及不同兼容性特征的启动子-终止子组合。这些调控元件将使丹参毛状根和再生植株中的基因表达控制更加精准灵活，特别适用于多基因途径工程、代谢工程以及该工业药用作物中植物源化合物的规模化生产。
