器官发生型愈伤组织介导的贯叶连翘（Hypericum perforatum）再生及优化诱导子促进金丝桃素生产

《Industrial Crops and Products》：Organogenic callus-mediated regeneration coupled with optimized elicitors for hypericin production in Hypericum perforatum

　　

本研究建立了贯叶连翘（Hypericum perforatum）的植株再生与目标代谢物生产体系；在6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）与NAA（萘乙酸）处理下，器官发生型愈伤组织分化率约达99.0%；MeJA（茉莉酸甲酯，50 μmol/L）为目标代谢物积累的最优诱导子；诱导子处理上调关键基因CCL2（辅酶A连接酶2）、PKS（聚酮合酶）和Hyp-1的表达水平。

研究背景：贯叶连翘（Hypericum perforatum L.）为多年生草本药用植物，传统用于镇静、抗炎、创面愈合等，目前为重要草药抗抑郁植物，其活性主要与萘并二蒽酮类化合物金丝桃素（hypericin，Hyp）有关。全球贯叶连翘产品市场约60亿美元/年，栽培面积扩大；但田间高产受环境胁迫敏感性、活性成分遗传不稳定及栽培周期长制约，化学变异和低代谢物含量仍未解决。已有生长条件优化、遗传选育、离体繁殖、细胞悬浮及诱导子（elicitor，可诱导次生代谢物积累的外源因子）等策略，但高效完整的离体植株再生与目标代谢物生产体系尚未建立。为此，研究人员建立组织培养繁殖与目标代谢物生产体系，比较外植体、激素和诱导子，并检测Hyp生物合成关键基因，旨在为快速繁殖与规模化悬浮培养提供基础。

研究开展与意义：研究人员比较无菌苗茎段与田间苗花药诱导愈伤，优化6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）与NAA（萘乙酸）诱导芽分化、IBA（吲哚丁酸）与GA₃（赤霉素A₃）诱导根及基质成活，建立悬浮培养并以SA（水杨酸）、MeJA（茉莉酸甲酯）、CuSO₄（硫酸铜）处理，测Hyp、总黄酮（total flavonoids）、总酚（total phenolic）及CCL2（辅酶A连接酶2）、PKS（聚酮合酶）、Hyp-1表达。结论是建立以茎源器官发生型愈伤组织（organogenic callus）为基础的全株再生，50 μmol/L MeJA为最优诱导子并上调关键基因；意义在于提出综合高效离体方案，为H. perforatum快速繁殖和大规模愈伤悬浮培养铺路。

关键技术方法（≤250字）：成熟种子采自中国甘肃省康县（1334 m a.s.l.; 33°16′20″N，105°31′50″E，2024年7月）；田间苗2025年3月栽培并移植至甘肃农业大学药草园（1550 m a.s.l.; 36°5′25″N，103°41′53″E），花蕾于2025年8月收集。研究比较无菌苗茎段与田间苗花药诱导愈伤；以6-BA与NAA组合诱导芽分化，IBA与GA₃处理根诱导，不同基质测幼苗成活；建立悬浮培养，用SA、MeJA、CuSO₄处理，测愈伤组织相对生长速率（CRGR）、Hyp、总黄酮和总酚，并以qRT-PCR（实时荧光定量PCR）检测CCL2、PKS和Hyp-1表达。

研究结果：
3.1 两种外植体的愈伤组织诱导率与继代褐化率比较：通过比较无菌苗茎段与田间苗花药，茎段愈伤诱导率98.50%高于花药67.01%，继代褐化率5.27%低于花药25.67%，茎段愈伤紧凑黄绿色，后续采用茎段愈伤。
3.2 6-BA与NAA组合对器官发生型愈伤组织芽分化的影响：通过不同浓度组合处理，6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L分化率最高99.0%，25 d获52个分化苗（13个大苗、13个中苗、26个小苗）。
3.3 IBA与GA₃对根诱导及培养基质对幼苗成活率的影响：通过IBA与GA₃处理及5种基质栽培，GA₃（0.5 mg/L）提高节数和基部苗数，IBA（0.5 mg/L）提高根长和根数；5种基质幼苗成活率均>94%且无显著差异。
3.4 培养时间与诱导子对愈伤组织相对生长速率（CRGR）的影响：通过培养时间与SA、MeJA、CuSO₄处理考察CRGR，总体以15 d培养及30 μmol/L SA、50 μmol/L MeJA较有利于生长。
3.4.1 培养时间对CRGR的影响：通过不同培养时间测定，CRGR随0–20 d增加，15 d后趋平且与20 d无显著差异，后续用15 d悬浮愈伤。
3.4.2 不同诱导子对CRGR的影响：通过SA、MeJA、CuSO₄不同浓度处理，CRGR均先增后降；30 μmol/L SA（0.77）和50 μmol/L MeJA（0.84）较高，200 μmol/L CuSO₄（0.54）较低，前二者无显著差异且显著高于后者。
3.5 诱导子对目标代谢物积累的影响：通过SA、MeJA、CuSO₄处理考察目标代谢物积累，总体以50 μmol/L MeJA最优。
3.5.1 对金丝桃素（Hyp）含量的影响：通过高效液相色谱（HPLC）测定，Hyp随诱导子浓度先增后降；50 μmol/L MeJA下Hyp 0.18 mg/g DW，显著高于30 μmol/L SA（0.16 mg/g DW）和200 μmol/L CuSO₄（0.13 mg/g DW）。
3.5.2 对总黄酮和总酚含量的影响：通过比色法测定，二者均先增后降；50 μmol/L MeJA下总黄酮/总酚为18.06/10.67 mg/g DW，显著高于30 μmol/L SA（8.30/7.13 mg/g DW）和200 μmol/L CuSO₄（6.27/7.64 mg/g DW）。
3.6 诱导子对Hyp生物合成关键基因表达水平的影响：通过qRT-PCR，30 μmol/L SA、50 μmol/L MeJA和200 μmol/L CuSO₄均显著上调CCL2、PKS和Hyp-1；以50 μmol/L MeJA下Hyp-1上调3.48倍、CCL2上调2.58倍，30 μmol/L SA下CCL2上调2.07倍、PKS上调2.03倍，200 μmol/L CuSO₄下PKS上调1.71倍等。
3.7 植株再生与目标代谢物生产的综合方案：基于上述结果提出综合方案，茎段经30 d诱导器官发生型愈伤、60 d诱导芽分化、茎切段30 d再生全株，基质成活率>94%；茎源愈伤21 d启动悬浮、15 d扩增，50 μmol/L MeJA处理15 d后提取目标代谢物；其长期稳定性和可放大性仍需验证。

讨论总结：讨论表明外植体类型影响愈伤诱导与褐化，细胞分裂素/生长素比例调控器官发生；GA₃偏向地上部生长而IBA促进根系；高浓度诱导子可能因细胞毒性抑制细胞活力和增殖，且细胞生长与次生代谢积累存在平衡，50 μmol/L MeJA在悬浮愈伤生长及Hyp、总黄酮、总酚积累和关键基因表达方面综合最优。

研究结论（译）：以无菌苗茎段诱导的器官发生型愈伤组织建立了贯叶连翘全株再生：6-BA（0.5 mg/L）与NAA（1.0 mg/L）组合诱导芽分化，GA₃（0.5 mg/L）促进地上部生长，IBA（0.5 mg/L）促进根形态发生。目标代谢物（Hyp、总黄酮、总酚）可通过愈伤悬浮培养联合优化诱导子（50 μmol/L MeJA）生产。基于研究提出综合高效离体方案，为H. perforatum快速繁殖和大规模愈伤悬浮培养铺路。尽管已建立再生和悬浮培养体系并检测Hyp生物合成关键基因表达，仍需进一步建立稳定转化体系以促进基因编辑（如CRISPR/Cas9）和功能基因验证，最终提高H. perforatum的Hyp含量。