人参锈腐病生物防治的转录组分析及PgWRKY72B增强抗病性的作用

《Industrial Crops and Products》：Transcriptomic analysis of biological control of rust rot in Panax ginseng and the role of WRKY72B in enhancing pathogen resistance

　　

摘要翻译：化学药剂通过油菜素内酯（BR）信号通路提高人参对锈腐病的抗性；内生细菌通过茉莉酸（JA）、油菜素内酯（BR）和乙烯（ETH）信号通路增强对锈腐病的抗性；PgWRKY72B过表达增强人参不定根（ARs）对锈腐病的抗性。

研究背景：人参（Panax ginseng C. A. Mey.）为五加科药食兼用植物，栽培条件严格、连作问题突出，土传病害造成产量和品质损失。锈腐病主要病原为Ilyonectria spp.，其中Ilyonectria robusta为主要致病菌，病原可在土壤中长期存活并作为初侵染源。化学防治速效，但易促进病原抗药性并造成农药残留；生物防治环境友好，但现有研究多集中于拮抗菌筛选、离体抑菌和防效验证，核心分子调控网络及作用模式研究不足。WRKY转录因子（一类植物特有转录因子）在生物胁迫响应中重要，但其调控人参锈腐病抗性的作用尚不清楚。研究人员基于前期分离的X14（Bacillus amyloliquefaciens）和X19（B. velezensis），开展转录组分析和PgWRKY72B功能验证，以揭示内生菌增强抗性的分子网络，并为抗锈腐病人参育种提供依据。

主要技术方法（≤250字）：以健康二年生人参根和离体培养4周不定根（ARs）为材料；病原菌为Ilyonectria robusta，内生菌X14（Bacillus amyloliquefaciens）与X19（B. velezensis）分离自人参田根际土壤（Zhao et al., 2025）。设T1–T6盆栽处理，5盆/重复；测纤维素酶、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和脯氨酸；气相色谱-质谱（GC-MS）测乙烯，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测JA和BR；3个生物学重复行转录组测序（RNA-seq，18文库，Illumina HiSeq 4000），DESeq2筛选差异表达基因（DEGs）并行GO/KEGG富集。克隆PgWRKY72B并实时定量PCR（qRT-PCR）分析；构建pORE-R4–35S::PgWRKY72B，经根癌农杆菌EHA105转化ARs，获OE-4、OE-7、OE-11；接种I. robusta后测防御/细胞壁酶活、qRT-PCR和扫描电镜（SEM）。

研究结果：
3.1 内生细菌对人参锈腐病感染的抑制作用：通过发酵液、无菌滤液和菌悬液抑菌试验及盆栽防效试验，发现两菌发酵液对I. robusta菌丝生长抑制至少99%，抑菌效果为发酵液>菌悬液>无菌滤液；T1、T2、T4病斑轻，T3中等，T5最重；T1/T3/T4的APX活性较高，T1/T2/T4纤维素酶活性较高，T1/T2/T4/T6脯氨酸低于T5。结论：内生菌和化学药剂均可通过维持细胞壁完整和激活抗氧化防御减缓锈腐病。
3.2 转录组数据全局分析：通过18个样本RNA-seq获115.46 Gb clean reads，Q30>93.11%，GC含量42.9%–44.06%，参考基因组比对率>96.78%；PCA显示T5与其他组分离；DEGs数分别为559、641、651和192，T2 vs. T5与T5 vs. T6组合最多。结论：测序质量合格，处理间转录组差异明显。
3.3 DEGs的KEGG富集分析：通过KEGG富集发现分别涉及99、94、98和63条通路，13条通路共同富集；T4特有“Cutin, suberin and wax biosynthesis”“Flavonoid biosynthesis”“Carbon fixation in photosynthetic organisms”；“Plant-pathogen interaction”在T1/T2/T3中富集。结论：生物防治与化学防治共享基础通路但各有特异通路。
3.4 植物激素代谢通路相关DEGs：通过激素通路DEG分析，T1/T2/T3富集BR、JA和细胞分裂素，T2还富集ABA和ETH，T4无细胞分裂素信号DEGs；JA合成基因在T1/T2中高于T4，部分在T3中高于T4；BR合成基因在T1中高于T2/T3，T4高于T2；ETH关键基因在T2中高于T6。结论：X14主要激活JA和BR，X19激活JA–BR–ETH，混合处理主要激活JA，化学药剂主要激活BR。
3.5 PgWRKY转录因子表达分析：通过转录组分析发现AP2/ERF、NAC、MYB、bHLH、WRKY和bZIP家族DEGs数分别为159、147、106、83、56和30；多个PgWRKY基因在T1/T2/T3中高于T4，部分基因在T1/T2中高倍数变化而在T4中无显著差异。结论：WRKY参与内生菌诱导的人参抗锈腐病响应。
3.6 PgWRKY72B表达及系统发育分析：通过qRT-PCR发现PgWRKY72B在根中相对表达最高（4.53），其次为种子和叶；接种锈腐病菌后表达逐渐升高，6 d达峰（3.85）后下降；系统发育分析显示其与HiWRKY72-like、LoWRKY72A、RcWRKY72B和AaWRKY72A同簇。结论：PgWRKY72B响应病原侵染并具组织表达特异性。
3.7 PgWRKY72B过表达增强人参ARs对锈腐病抗性：通过构建过表达载体并经A. tumefaciens介导转化ARs，PCR确认OE-4/OE-7/OE-11且qRT-PCR显示表达升高；接种I. robusta后3 d野生型（WT）可见孢子萌发和菌丝生长而OE未见，6 d OE见孢子萌发而WT菌丝快速增殖；OE中PAL（苯丙氨酸解氨酶）、CAT（过氧化氢酶）、POD（过氧化物酶）、PPO（多酚氧化酶）活性高于WT，OE-4第6天分别达333.07 U g^?1、30.33 U g^?1、4.98 U g^?1和22.58 U g^?1；PG（多聚半乳糖醛酸酶）和PME（果胶甲酯酶）活性低于WT；PgPRS2、PgEXPB、PgPRM、PgCAT和PgCSC表达升高，PgEG降低。结论：PgWRKY72B过表达增强ARs对锈腐病的抗性。

讨论总结：讨论认为，X14/X19单独或联合及化学药剂均通过保持细胞壁完整、激活抗氧化系统减轻症状；X14上调JA和BR，X19触发JA–BR–ETH协同，混合处理仅上调JA，可能与菌株共定殖竞争有关；化学药剂主要诱导BR。PgWRKY72B可能通过上调核苷酸结合位点–富亮氨酸重复（NBS-LRR）类抗病基因PgRPS、PgRPM及细胞壁合成相关PgEXPs、PgCSC，增强PAL/CAT/POD/PPO并降低PG/PME，同时激活JA合成，从物理防御、免疫识别和化学防御多层面限制病原；原文指出PgWRKY72B是否直接结合PgRPS/PgRPM或JA/细胞壁基因W-box启动子尚需酵母单杂交和ChIP-qPCR验证。

研究结论部分翻译：总之，X14上调锈腐病感染人参中JA和BR代谢通路相关基因；X19提高JA、BR和ETH代谢通路基因表达；X14+X19组合仅上调JA代谢通路相关基因，而hymexazol（恶霉灵）处理诱导BR代谢通路相关基因上调。这些结果表明，PgWRKY72B上调病程相关基因PgRPS和PgRPM的表达，并增强关键防御相关酶和细胞壁生物合成酶活性；这些变化可能有助于增强人参对锈腐病的抗性。