通过超声波辅助酶解实现牛血的可持续高值化利用，以回收功能性蛋白质和多肽

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Sustainable valorization of bovine blood through ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis for functional protein and peptide recovery

　　

# 摘要

牛血是一种尚未充分利用的屠宰场副产品，具有作为高价值蛋白质和生物活性肽可持续来源的潜力。本研究通过酶解（EH）和超声辅助酶解（USAEH）对牛血进行价值提升，评估了其成分、分子量（MW）分布、表面特性及技术功能特性。加工过程生成了蛋白质和肽组分，蛋白质含量较高（干物质基础约为89%–97%）。EH和USAEH产生了相似的分子量分布，约57%–60%的色谱面积对应于0.075–0.2 kDa范围内的肽。EH和USAEH还改变了蛋白质表面特性，降低了表面疏水性并改变了ζ电位。溶解度从牛血的85.3%提高到USP-25组分的98%。乳化稳定性指数从22.9分钟增加到27.1分钟，而发泡能力从牛血的84%提高到USP-100组分的124.7%。氨基酸分析确认了其营养相关的组成，必需氨基酸含量均衡。总体而言，分子尺寸和表面特性的变化与某些技术功能特性的改善相关，尽管不同处理和方法的效果有所差异。这些发现突显了USAEH在从牛血生产功能性蛋白质配料以供食品和营养保健应用的潜力。

# 引言

动物血液是屠宰场肉类加工的主要副产品，通常每100公斤活重可产3–5升（Kosti?等人，2014）。全球范围内，牛的平均血液产量占活重的4.5%，猪约为3.5%。其高氮负荷（约30克/升）意味着未经控制的排放会消耗溶解氧并促进腐败和微生物污染，这强调了有效价值提升策略的必要性（Chiroque等人，2023；Nazifa等人，2021）。全血通常含有18%–20%的总固体，主要包括13%–15%的蛋白质、约2%的盐类和微量的脂质和碳水化合物（<1%）（González，2012）。在这些成分中，蛋白质在营养和工业方面最为相关，并已被广泛探索作为功能性食品配料（Del Hoyo, Rendueles & Díaz，2008）。血液蛋白质被广泛用作稳定剂、乳化剂和澄清剂，也可作为部分乳制品替代品，增强配方食品的质构和营养价值（Hyun & Shin，2000）。

酶解（EH）能够实现具有不同功能特性的生物活性肽序列的受控释放。先前的研究已鉴定出源自红细胞和血浆蛋白、具有抗氧化、抗高血压和抗菌活性的肽（Alves, Teixeira, ávila, Ribani & de Paula Scheer，2020；Olagunju, Omoba, Enujiugha, Alashi & Aluko，2018）。源自血液蛋白水解物的抗氧化肽（Verma, Chatli, Kumar & Mehta，2019）因其抑制食品体系中氧化反应的潜力而受到特别关注。此类肽在含有血红素铁或血红素蛋白的配方中可能尤为宝贵，因为它们可以帮助减轻氧化相关的质量劣变并增强产品稳定性（Berraquero-García, Almécija, Guadix & Pérez-Gálvez，2022）。尽管EH有效，但其可能受限于相对较长的加工时间、酶成本和底物可及性不完全（Wang等人，2012；de Carvalho Silvello等人，2020）。因此，超声辅助（USA）加工作为一种过程强化策略引起了越来越多的关注，该策略能够增强酶-底物相互作用并提高水解效率（Kabawa, Sampers & Raes，2023；Koirala, Prathumpai & Anal，2021）。除了提高水解效率外，USA加工还有潜力缩短加工时间和减少酶用量，尽管这些优势取决于加工条件。除了血液蛋白外，超声辅助酶解（USAEH）已成功应用于多种蛋白质底物，包括鱼类、乳制品和植物蛋白。先前的研究表明，与传统的EH相比，超声处理能够促进蛋白质结构修饰并产生具有理想功能特性的肽（Chu等人，2025；Ma等人，2023；Magalh?es, Guimar?es, Tribst, de Oliveira & Júnior，2022）。

在血液基质中，细胞结构会限制酶对细胞内蛋白的接触，从而限制水解效率。超声处理可以通过空化作用破坏这些结构屏障，增强蛋白质释放并促进后续的酶降解。空化作用受超声频率和若干其他操作参数的影响，包括振幅、声功率/强度、脉冲持续时间、占空比、超声处理时间和温度，以及处理介质的物理化学性质。较低频率通常产生更具破坏性的机械效应，促进细胞破坏和大分子溶解（Zhu, Das, Bhavya, Garcia-Vaquero & Tiwari，2024；Bougrier, Carrère & Delgenes，2005；Timothy and John，2002）。先前的研究表明，超声能够增强蛋白质溶解和大分子底物的解聚（Lee & Shin，2003；Portenlanger等人，1999；Wang, Lu & Ji，2006），突显了超声作为互补预处理以改善血液来源蛋白质回收和水解的潜力。Jeon和Jeon（2024）的最新工作表明，超声预处理显著提高了家畜血液中的EH效率。在优化条件（30分钟超声处理，0.5 W/mL）下，血红蛋白溶解度达到约96%，后续蛋白水解产生的氨基酸（AA）浓度显著高于未超声对照组。这些发现突显了USA加工在提高血液来源生物材料蛋白质降解和价值提升方面的有效性。然而，该研究主要集中于改善蛋白质可降解性和氨基酸产量，以用于肥料应用。

尽管先前的研究探索了血液来源蛋白质水解物和肽的回收和功能潜力（Verma等人，2019），但USAEH在牛血中生产功能性蛋白质和肽组分的应用仍然相对缺乏研究。在共同的酶处理框架内对槽式和探头式超声系统的比较研究仍然有限。因此，本研究旨在系统评估不同超声加工条件（使用槽式和探头系统）对牛血来源蛋白质和肽组分的物理化学、组成、表面和技术功能特性的影响。为实现这一目标，在传统的EH和USAEH处理中一致应用选定的酶混合物，其中槽式超声在EH过程中同时应用，探头式超声在EH之前作为预处理应用。所得组分根据水解度（DH）、蛋白质和矿物质组成、超高效液相色谱荧光检测法（UHPLC-FLD）确定的氨基酸谱、尺寸排阻色谱法评估的分子量分布、蛋白质表面特性和关键技术功能属性进行了表征。通过比较这些加工条件，本研究试图探索超声处理、肽特性、蛋白质表面特性与技术功能性能之间的关系。这一综合框架提供了血液来源蛋白质和肽组分的结构特性与技术功能性能之间关系的见解，同时突显了酶解和超声加工联合应用于从屠宰场副产品生产增值配料的潜力。

新鲜牛血取自当地屠宰场（爱尔兰韦克斯福德郡）。血液在不使用抗凝剂的情况下收集，在冷藏条件下运输，并在?20°C下储存直至进一步加工。

包括Alcalase?（来源于地衣芽孢杆菌，3.218 U/mL；批号4328833）、Neutrase?（来源于短芽孢杆菌，≥0.80 U/g；批号1003593227）和Flavourzyme?（来源于米曲霉，≥0.500 U/g；批号0000353150）的蛋白水解酶均购自Merck Life Science（爱尔兰）。商业酶制剂按照制造商的规格和活性声明使用。选择这三种酶是因为它们具有不同的蛋白水解特性：Alcalase主要表现出内肽酶活性，Neutrase在相对温和的条件下表现出广谱蛋白水解活性，而Flavourzyme同时含有内肽酶和外肽酶活性。因此，研究了使用具有不同蛋白水解特性的酶作为策略，以实现牛血蛋白质的充分水解。随后通过以DH作为筛选标准的初步试验实验评估了酶系统的适用性。所有使用的化学品均为分析纯。盐酸（HCl，37% v/v）、混合氨基酸标准品（500 μM）、邻苯二醛（OPA，≥99%）、3-巯基丙酸（MPA，≥99%）、6-氨基己酸（ACA，≥99%）、十水合四硼酸钠（99.5%–105.0%）、三氯乙酸（TCA，≥99%）、甲磺酸（MSA，≥99.5%，LC-MS级）和氢氧化钠（NaOH，≥98%）均购自Sigma-Aldrich（德国）。十二烷基硫酸钠（SDS，92.5%–100.5%）由Fisher Scientific（英国）提供，而牛血清白蛋白（BSA，≥98%）则来自GE Healthcare。

图1以示意图形式展示了使用EH和USA处理牛血的加工流程。首先，使用NutriBullet 900 Series搅拌机（中国）以24,000转/分钟的转速对牛血进行匀浆处理，以促进细胞破坏和样品均匀性。使用三种加工途径研究了五种处理：单独EH（EHC）、EH与25或45 kHz槽式超声同时进行（分别为USB-25和USB-45），以及在25%或100%振幅下进行探头超声预处理后接EH（分别为USP-25和USP-100）。每种处理使用1升样品量。

（A）酶解对照组（EHC）：1升匀浆化牛血使用Alcalase?（地衣芽孢杆菌）、Neutrase?（短芽孢杆菌）和Flavourzyme?（米曲霉）的酶混合物进行EH，总浓度为1.5%（v/v）。酶混合物的选择基于Ghalamara等人（2026）先前报道的初步筛选，在该筛选中，在3小时的固定水解时间和1.5%（v/v）的总酶浓度下，三种酶分别和以不同组合进行了评估。该研究中达到最高DH的组合被选用于本实验，在EHC和USAEH处理中，三种酶均作为单一混合物同时添加。这种方法保持了一致的酶添加策略，使得能够研究不同超声加工条件的影响，而不引入酶添加顺序作为额外变量。未评估顺序酶添加。水解在pH 7.4和50°C下在100转/分钟连续搅拌条件下进行3小时。这些条件在EHC和所有USAEH处理中保持一致，以便比较所研究的超声加工条件的影响。pH的选择是为了维持牛血的天然pH并避免不必要的调整，而50°C的选择是为了支持有效的水解并确保处理间的一致性。使用恒温水浴配合连续搅拌维持温度。通过酸化至pH 4.5后加热灭活（90°C，2分钟）终止水解。酸化在加热前迅速降低了酶活性，从而最小化了完全灭活酶所需的热暴露。随后将水解物在10,000×g下离心15分钟（Thermo Fisher Scientific，爱尔兰都柏林），以获得澄清水解物。

评估了两种超声系统，以研究不同超声加工条件对EH及所得蛋白质和肽组分特性的影响。槽式系统提供间接超声暴露，声能通过水浴水和样品容器传递，而探头系统直接将声能传递至样品中。系统在超声应用时机上也不同：在槽式处理中，超声在整个3小时EH期间同时应用，而在探头处理中，超声作为30分钟预处理在3小时EH处理之前应用。在解释所研究的加工条件对水解及所得组分特性的影响时，考虑了这些差异。

（B）超声辅助酶解（USAEH-槽式系统）：1升含有与EHC相同酶混合物和1.5%（v/v）总酶浓度的匀浆化牛血进行同时EH和槽式超声处理。在整个3小时水解期间（分别为USB-25和USB-45），使用水浴超声系统（Elmasonic Xtra ST系列，Elma Schmidbauer GmbH，德国）以25或45 kHz运行，在与EHC相同的EH条件（pH 7.4，50°C，3小时）和EHC描述的后续后水解程序下进行。通过连接至超声水浴的制冷循环器持续监测并维持温度在约50°C，从而控制超声引起的温度波动并维持EH所需的温度。选择不同频率是为了评估槽式超声频率对EH及所得组分特性的影响。

（C）超声辅助酶解（USAEH-探头系统）：使用直接探头超声系统（Hielscher UIP1000hdT，1000 W，德国），配备直径32毫米的换能器，浸入液面下30毫米，以25%或100%的振幅进行30分钟处理。对于每种处理，1升样品接受探头超声处理。探头超声在无酶存在的情况下作为预处理进行。30分钟超声处理后，将样品温度升至50°C，加入选定的酶混合物，并在EHC描述的条件（pH 7.4，50°C，3小时）下开始EH。在整个超声处理过程中持续监测温度。在25%振幅下，温度保持在30°C以下，而在100%振幅下，使用冰浴限制超声引起的加热并将样品温度维持或控制在约30°C以下。

水解度（DH）和牛血及其衍生蛋白/肽组分组成特征

水解度（DH），即蛋白质底物中肽键断裂的比例，是评价酶解（EH）程度和效率的重要指标（Zhao等，2024）。对Alcalase?、Neutrase?和Flavourzyme?单独及不同组合进行初步筛选后，在所评估条件下得到的DH值介于27.89%至45.25%之间。所选三种酶组合表现出最高的DH值（45.25 ± 1.67%），与之前针对相同对象的报道一致。

结论

本研究展示了通过酶解与超声（US）处理相结合对牛血进行增值利用的潜力，这为将屠宰副产物升级为潜在高价值蛋白原料提供了一种可持续策略。联合处理工艺生成了具有不同蛋白质含量和相对矿物质组成差异的蛋白质与肽组分。酶解是肽分子量降低的主要驱动力，而超声的引入则适度增强了……

CRediT作者贡献声明

Soudabeh Ghalamara：撰写—原始草稿、可视化、方法学、调查研究、形式分析、数据整理。
Mohammad Bayati：撰写—审阅与编辑、形式分析。
Sara Pérez-Vila：撰写—审阅与编辑、形式分析。
Laura G. Gómez-Mascaraque：撰写—审阅与编辑、验证。
Mahesha M. Poojary：撰写—审阅与编辑、验证。
Shay Hannon：撰写—审阅与编辑、验证、监督、资源提供。
Brijesh K. Tiwari：撰写—审阅与编辑。

未引用参考文献

AOAC 920.153, 1920
AOAC 992.15, 1992
Li, Zhao and Xu, 2022
Mason and Lorimer, 2002
Portenlanger, 1999
da Silva Bambirra Alves et al., 2021

利益冲突声明

作者声明，他们不存在可能影响本研究中所述工作的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢CirCoVal项目提供的支持，该项目由爱尔兰农业部、食品和海洋部（DAFM）通过2023年政策与战略研究资助计划共同资助，资助协议编号：2023RP1040。

Soudabeh Ghalamara | Mohammad Bayati | Sara Pérez-Vila | Laura G. Gómez-Mascaraque | Mahesha M. Poojary | Shay Hannon | Brijesh K. Tiwari
Teagasc食品研究中心，都柏林阿斯敦，爱尔兰