《International Journal of Biological Macromolecules》：The LtrA protein positively regulates borrelidin biosynthesis in
Streptomyces rochei by modulating
borB expression and interacting with key cellular proteins
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摘要链霉菌JK1中波雷里定生物合成的机制基础——对拮抗多毛疫霉至关重要——仍然不明确。为鉴定关键调控基因，我们构建了一个紫外线诱变的突变体文库，并筛选了丧失波雷里定产生能力和抗真菌活性的菌株。一个紫外线诱变突变体（60 s1）表现出波雷里定产生和抑菌功能的缺失，通过对该突变体
摘要
链霉菌JK1中波雷里定生物合成的机制基础——对拮抗多毛疫霉至关重要——仍然不明确。为鉴定关键调控基因，我们构建了一个紫外线诱变的突变体文库，并筛选了丧失波雷里定产生能力和抗真菌活性的菌株。一个紫外线诱变突变体（60 s1）表现出波雷里定产生和抑菌功能的缺失，通过对该突变体进行全基因组重测序，鉴定出LtrA为一个关键的正向调控因子。RT-qPCR验证了LtrA上调borB（波雷里定生物合成中的关键基因）的表达，从而建立了一个核心调控级联。分子实验表明LtrA与FtsK/SpoIIIE（基因组稳定性）以及Crp/Fnr（cAMP信号传导）相互作用，整合了基因组完整性与信号通路。虽然cAMP能够恢复ltrA突变体的形态特征，但未能恢复JK1对多毛疫霉的抑制活性，表明LtrA介导的波雷里定调控与形态控制是相互独立的。过表达ltrA可使波雷里定产量提高78.84%，进一步证实了其调控核心地位。过表达ltrA可增强链霉菌的生物学防治效果，为农业病害管理提供了微生物工程策略。
引言
链霉菌是一类重要的天然抗生素和生物活性次级代谢产物生产菌株，其次级代谢的调控机制长期以来一直是微生物学和合成生物学中的关键科学问题。波雷里定是一种具有强效抗卵菌活性的聚酮类代谢产物，对多种病原性卵菌（包括大豆疫霉）具有显著的拮抗作用，在土传病害的生物学防治中具有重要的应用价值[1], [2]。然而，波雷里定生物合成的调控网络——尤其是关键调控基因和分子机制——仍然基本不清楚[3]，这极大地阻碍了通过基因工程方法提高生产菌株的生物合成效率和生物学防治性能的发展。
罗氏链霉菌JK1是一种具有良好生物学防治潜力的放线菌菌株。它通过产生波雷里定等生物活性代谢产物来抑制多种土传卵菌的生长，并且能够稳定定殖于作物根际和根组织；其培养滤液也表现出稳定的抑菌活性，对于减少化学农药依赖和促进生物农药开发具有重要价值[4], [5]。该菌株对姜根腐病的病原菌——多毛疫霉表现出显著的拮抗活性。姜作为一种全球重要的经济作物，其生产长期受到这种土传卵菌病害的严重威胁，制约了姜产业的可持续发展[6], [7]。然而，该菌株中波雷里定生物合成的调控机制尚未阐明，关键调控因子仍有待鉴定，这是该菌株遗传改良的重大瓶颈。深入了解这些通路对于理性遗传工程改造链霉菌菌株以增强其生物学防治性能至关重要。
为鉴定罗氏链霉菌JK1中调控波雷里定生物合成的关键调控因子，我们首先构建了一个紫外线诱变突变体文库，筛选了对多毛疫霉丧失拮抗活性的菌株。获得了一个波雷里定缺失突变体，随后通过全基因组重测序鉴定出低温需求蛋白A（LtrA）作为一个候选正向调控因子。LtrA是细菌中一种保守的功能蛋白，最早在单增李斯特菌中被鉴定，其缺失会导致低温条件下生长受损，表明其在冷适应和生长调控中的关键作用[8]。虽然后续研究表明LtrA参与了放线菌的次级代谢和应激反应，但其在抗生素生物合成中的具体功能及其调控方式仍然未知。这一知识空白促使我们探讨两个核心问题：(1) LtrA是否在链霉菌中调控波雷里定的生物合成？(2) LtrA如何影响链霉菌对多毛疫霉的拮抗活性？为解决这些问题，本研究旨在为解析波雷里定调控网络提供理论基础，并开发一种优化链霉菌菌株以增强其生物学防治应用的新策略。
章节摘要
菌株、质粒和培养条件
罗氏链霉菌JK1已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC No. 17115）。所有链霉菌菌株均在28°C的戈氏1号琼脂培养基上培养，并在28°C的玉米粉液体培养基中进行发酵（180 rpm）；多毛疫霉SWQ7在V8琼脂培养基上培养。大肠杆菌DH5α用于质粒构建，大肠杆菌ET12567/pUZ8002作为大肠杆菌-链霉菌属间接合的供体，大肠杆菌Rosetta(DE3)用于蛋白表达。
LtrA被鉴定为波雷里定合成的关键正向调控因子
为鉴定调控野生型JK1拮抗活性的调控元件，我们通过对JK1单孢子悬液进行不同照射时间的紫外线诱变构建了一个突变体文库。获得的突变体通过与多毛疫霉进行平板对峙实验和高效液相色谱（HPLC）分析检测波雷里定产量，从中获得了突变体60 s1。该突变体完全丧失了对多毛疫霉的抑制作用（图1A）。HPLC分析
讨论
LtrA在波雷里定生物合成中的核心调控作用在调控次级代谢产物生物合成的复杂调控网络中显而易见，其中转录调控因子和必需功能蛋白发挥着尤为关键的作用。紫外线诱变突变体60 s1完全丧失了对多毛疫霉的抑制作用，未检测到波雷里定；全基因组测序显示ltrA、rpoB和arr存在突变。由于先前研究已证实rpoB/arr突变（例如菌株
CRediT作者贡献声明
孟佳雨：撰写——初稿，可视化，验证，调查，形式分析，数据整理。陈露：调查，形式分析，数据整理。周冬梅：撰写——审阅与编辑。邓生：形式分析。冯辉：撰写——审阅与编辑。王楠：形式分析。张金凤：方法论。赵敏：撰写——审阅与编辑。韦立辉：监督，资源，经费获取。张桂英：监督，经费获取。王晓雨：撰写——
利益冲突声明
作者声明不存在已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
本工作得到了国家农业科技创新体系专项资金（CARS-22）的支持。
孟佳雨|陈露|周冬梅|邓生|冯辉|王楠|张金凤|赵敏|韦立辉|张桂英|王晓雨
