《International Journal of Biological Macromolecules》：Meloidogyne enterolobii effector transthyretin-like protein 1 targets plant heat shock protein 90 to manipulate host immunity and promote nematode parasitism
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摘要根结线虫属（Meloidogyne enterolobii）寄主范围广、致病性强，是造成经济损失最严重的根结线虫种类之一。M. enterolobii 分泌的效应蛋白是线虫与其寄主之间相互作用的关键分子。本研究对M. enterolobii的一种转甲状腺素蛋白样效应蛋白（
摘要
根结线虫属（Meloidogyne enterolobii）寄主范围广、致病性强，是造成经济损失最严重的根结线虫种类之一。M. enterolobii 分泌的效应蛋白是线虫与其寄主之间相互作用的关键分子。本研究对M. enterolobii的一种转甲状腺素蛋白样效应蛋白（MeTTL1）进行了功能表征。原位杂交结果显示，MeTTL1在M. enterolobii背侧食道腺中特异性表达，转录水平在寄生早期达到峰值。免疫定位证实MeTTL1在线虫迁移过程中持续分泌至植物体内，并积累于巨细胞中。寄主诱导基因沉默（HIGS）处理MeTTL1后，线虫寄生能力显著降低，根瘤数减少43.6%，线虫数量减少64.1%；而拟南芥中过表达MeTTL1则表现出对M. enterolobii的易感性增强，根瘤数增加117.1%，线虫数量增加77.7%。此外，MeTTL1通过减弱flg22诱导的胼胝质沉积、抑制Gpa2/Rbp1触发的细胞死亡以及下调防御相关基因表达，主动抑制植物免疫。荧光素酶互补实验和共免疫沉淀分析表明，MeTTL1与植物Hsp90家族成员发生互作，而Hsp90家族已知参与植物免疫反应。进一步验证表明，MeTTL1的C末端区域对互作至关重要。值得注意的是，拟南芥hsp90.3突变体表现出对M. enterolobii的易感性增强，支持了MeTTL1-Hsp90.3互作在寄生过程中的生物学意义。综上，本研究证明MeTTL1是M. enterolobii分泌的关键毒力因子之一，其通过靶向植物Hsp90家族蛋白抑制寄主免疫，从而促进线虫寄生。
引言
目前已报道的植物寄生线虫（PPN）种类超过4000种，是全球造成作物年损失约1570亿美元的重要害虫类群[1], [2]。根结线虫（RKNs，Meloidogyne spp.）为定居性内寄生线虫，通过诱导寄主根部形成巨细胞获取营养，从而破坏根组织的正常分化和生理功能[3]。与其他根结线虫相比，M. enterolobii毒力更强，其单独侵染即可导致番茄产量损失超过60%[4]。此外，M. enterolobii无法被多个广泛应用的抗性基因所控制，包括番茄中的Mi基因、马铃薯中的Mh基因以及大豆中的Mir1基因[5]。
根结线虫在侵染过程中向植物体内分泌多种效应蛋白。大多数效应蛋白由线虫食道腺产生，少数则分布于头部感器、尾部感器或表皮中[6], [7]。植物寄生线虫效应蛋白的功能可分为以下几个方面：（i）降解或软化植物细胞，例如Heterodera avenae的Ha-pel-1[8]、M. enterolobii的Me-pel2[9]以及Globodera rostochiensis的Gr-EXPB1[10]；（ii）抑制植物免疫反应，例如Meloidogyne javanica的MjTTL5通过与AtFIRc互作，显著提高寄主活性氧（ROS）清除能力[11]，以及Globodera pallida的RHA1B通过降解StNILR1抑制植物免疫反应[12]；（iii）调控植物分化信号，例如Meloidogyne javanica的Mj-CM-1通过影响激素合成抑制植物免疫[13]。总之，效应蛋白在线虫侵染、建立寄生关系以及改变寄主细胞形态和功能中发挥关键作用。
转甲状腺素蛋白样蛋白（TTL）家族是一个高度保守的蛋白家族，其成员均含有保守的TTR-52结构域。寄生线虫中TTL表达序列标签（ESTs）的数量显著多于自由生活线虫，尤其在寄生阶段更为明显[14], [15]。此外，不同TTL蛋白在线虫物种间表现出不同的亚细胞定位和功能。在Radopholus similis中，TTL1定位于阴门区域，TTL2定位于腹神经索[14]。在M. javanica中，MjTTL5定位于亚腹侧食道腺[11]。MgTTL1特异性定位于食道腺细胞，并受miRNA mgr-mir-228负调控，作为ROS介导的植物免疫的负调节因子发挥作用[16]。迄今为止，MjTTL5是唯一已知具有明确寄主靶标（AtFTRc）和分子功能（抑制ROS爆发）的线虫TTL蛋白[11]。然而，MeTTL1与MjTTL5仅有37.5%的氨基酸一致性，表明TTL家族内部存在显著的功能分化。MeTTL1是否识别不同的寄主靶标，或已演化出全新的毒力机制，目前尚不清楚。解答这些问题对于理解TTL蛋白如何功能分化以促进不同线虫物种的寄生至关重要，并可能揭示新的效应蛋白靶标用于作物保护。
植物热激蛋白90（Hsp90）是一个在不同生物中高度保守的蛋白家族[17]。拟南芥中存在7个Hsp90蛋白，其中AtHsp90.2、AtHsp90.3和AtHsp90.4的氨基酸序列高度相似（97.46%）。这三种同工酶的C末端区域含有保守的MEEVD五肽基序，这是动植物细胞质Hsp90的典型特征。在高温胁迫下，Hsps迅速积累，参与植物抗逆途径，帮助维持细胞稳态[18]。此外，Hsp90还参与信号分子的形成、信号转导以及蛋白质的正确折叠[19]。例如，木薯（Manihot esculenta）Hsp90通过与MeSRS1和MeWRKY20互作，精细调节生长素与水杨酸之间的平衡，从而调控木薯抗病性[20]。尽管Hsp90是植物中重要的分子伴侣，但关于Hsp90介导的植物免疫反应的研究仍十分有限。
尽管M. enterolobii具有重大经济重要性，但其成功寄生的分子机制仍知之甚少，尤其是其分泌的效应蛋白功能尚待阐明。TTL蛋白已在其他线虫物种的寄生过程中被报道发挥作用，但其在M. enterolobii中的角色尚未被表征[11]。本研究鉴定并功能表征了M. enterolobii的一种TTL效应蛋白，命名为MeTTL1。我们证明MeTTL1在背侧食道腺中特异性表达，且该蛋白在侵染过程中被分泌至取食位点。通过寄主诱导基因沉默、过表达、免疫学检测以及蛋白互作分析，我们发现MeTTL1通过靶向植物Hsp90家族抑制寄主防御，从而促进线虫寄生。值得注意的是，拟南芥中AtHsp90.3的敲除导致了对M. enterolobii易感性增强，进一步支持了Hsp90在该线虫防御中的作用。本研究揭示了M. enterolobii操纵植物免疫的新型机制，并将MeTTL1确定为开发新型线虫防控策略的潜在靶标。
各节摘要
线虫与植物材料
M. enterolobii采自海南辣椒。为建立纯系群体，取单一卵块进行分离，孵化后的二龄幼虫（J2）接种于温室栽培的水空心菜（Ipomoea aquatica）根部进行扩繁。拟南芥种子用0.1%次氯酸钠表面灭菌20–30分钟，随后用无菌水冲洗6–8次，然后播种于Murashige和Skoog（MS）培养基上，在22°C、16小时光照/8小时黑暗条件下培养
M. enterolobii MeTTL1基因的生物信息学分析
在此前研究中，我们对M. enterolobii进行了比较转录组分析，获得了75个潜在效应蛋白[43]，其中包括MeTTL1（登录号：IK2WLD401CC5IY）。基因全长cDNA的序列分析显示，MeTTL1包含一个468 bp的开放阅读框，编码155个氨基酸的蛋白质。MeTTL1的N端区域含有一个21个氨基酸的信号肽，这是分泌至寄主细胞内的线虫效应蛋白的典型特征。此外，一个转甲状腺素蛋白样
讨论
转甲状腺素蛋白样蛋白是线虫中最大的蛋白家族之一。尽管其分布广泛，但其生物学功能仍知之甚少[47], [48]。本研究鉴定并功能表征了M. enterolobii的MeTTL1效应蛋白。
不同TTL蛋白表现出不同的表达模式，可能在线虫中执行专门的生物学功能。MeTTL1与M. graminicola的MgTTL1具有最高的氨基酸一致性（73.29%）（图1），然而
CRediT作者贡献声明
张晓涵：撰写——初稿、调查、形式分析、数据整理。沈宏丽：方法论、调查、数据整理。孙旺婷：验证、方法论。詹恒：监督、资源、概念化。刘倩：撰写——审稿与编辑、监督、资源、项目管理。
资助信息
本研究受国家重点研发计划（2023YFD1400401）资助。
张晓涵|沈宏丽|孙旺婷|詹恒|刘倩
