顺序提取莪术多糖的结构表征与构效关系：在AlCl3诱导的斑马鱼模型中的抗阿尔茨海默病活性

《International Journal of Biological Macromolecules》：Structural characterization and structure-activity relationship of polysaccharides from Curcuma kwangsiensis extracted sequentially: Anti-Alzheimer's activity in an AlCl 3-induced zebrafish model

　　

四组分GYJPs经逐级提取后，其分子量（Mw）和单糖组成表现出显著差异。广西莪术多糖（GYJPs）可逆转氯化铝诱导的小鱼运动功能障碍。GYJPs能降低神经元凋亡，效果排序为GYJ-W > GYJ-Na > GYJ-0.1 M > GYJ-C。构效关系将分子量/组成与AD标志物及抗氧化–抗凋亡效应相关联。GYJ-W在多靶点读数中表现出最为一致的改善效果。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种中枢神经系统退行性疾病，以进行性认知功能障碍和行为缺陷为特征[1]。其发病机制高度复杂，涉及β-淀粉样蛋白沉积、tau蛋白过度磷酸化、神经炎症和氧化应激等多种病理过程。因此，单一靶点干预难以逆转疾病进展[2, 3, 4, 5]。随着全球人口老龄化加剧，AD的发病率和死亡率持续攀升。预计到2050年，全球AD患者人数将超过1.5亿，构成重大的公共卫生危机，威胁老年人健康并加重社会医疗系统负担[6]。因此，开发多靶点、低毒性的AD治疗药物迫在眉睫。目前临床使用的药物，如利伐斯的明、加兰他敏和Namzaric，均属于单一靶点抑制剂，仅能缓解症状而无法延缓疾病进展[7, 8]。中药复方已长期用于AD的治疗[9, 10, 11]，但其药理机制不明确，限制了临床推广应用。天然生物大分子，如源自中药植物的多糖，具有潜在的多靶点治疗作用和良好的安全性，在神经退行性疾病研究领域引起了日益增长的关注[12, 13, 14]。既往研究已证明，从黄精、黄芪、茯苓和杜仲等中药中提取的天然多糖具有显著的抗AD活性[15, 16, 17, 18]。此外，寡聚甘露糖钠胶囊（GV-971）的成功开发也展示了中药植物多糖通过多靶点作用模式治疗AD的独特优势[19, 20, 21]。然而，多糖的生物活性由其化学结构决定。既往研究表明，低分子量多糖（≤10 kDa，如壳寡糖和全乙酰化壳寡糖）可直接进入细胞或穿越血脑屏障，从而发挥特定的神经保护作用[22]。相比之下，高分子量多糖（>100 kDa，如香菇多糖和六妹羊肚菌多糖）主要通过肠道微生物–肠–脑轴发挥作用，由肠道微生物代谢产生生物活性代谢物[23]。富含阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）和半乳糖（Gal）的多糖（如白毒伞多糖和沙棘多糖）往往展现出更广泛的靶点覆盖性[24]。此外，含有葡萄糖醛酸（Glc A）和半乳糖醛酸（Gal A）的酸性多糖已被报道主要通过静电相互作用抑制Aβ聚集。再者，分支度较高的多糖（如β-葡聚糖）往往表现出更强的免疫调节活性[25]。因此，仅比较多糖处理组与空白对照组不足以阐明观察到的生物活性的物质基础，也无法回答哪些结构特征决定治疗效果以及不同多糖成分如何介导其内在机制这一根本问题。鉴于此，本研究对广西莪术多糖进行了分级和表征，旨在明确活性多糖成分的结构特征。我们进一步研究了构效关系（SAR），为多靶点抗AD机制提供基于结构的证据，并指导未来药物开发。

广西莪术（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang，姜科）是姜属中的一味药用物种，其干燥根茎在中药中被称为郁金。它最早记载于《药性论》，已有超过1000年的药用历史，具有行气解郁、活血止痛、清心凉血和利胆退黄的疗效[26]。对广西莪术的化学成分研究已鉴定出挥发油、多糖、二苯庚烷和生物碱等多种化合物[27, 28]。现代药理学研究已证实这些化合物的有益作用，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化和神经调节作用[29, 30]。关于广西莪术化学成分和药理作用的研究主要集中在小分子上[26, 31]，而关于其多糖的研究仍然有限。一项研究通过热水提取后柱层析分离，从广西莪术中分离出中性多糖（WPCK-N）和酸性多糖（WPCK-A）[32]。对其化学组成、分子量和微观形态进行了表征。结果显示，WPCK-N和WPCK-A的总糖含量分别为76.16%和54.02%，分子量（Mw）分别为2.88×10? Da和1.39×10? Da。WPCK-N主要由葡萄糖（Glc）组成，而WPCK-A主要由半乳糖（Gal）和葡萄糖（Glc）组成，并含有显著量的糖醛酸。两种多糖均呈现粗糙的表面形态，其中WPCK-N粒径较小。然而，该研究未进一步探讨其高级结构。此外，关于广西莪术多糖的研究仅限于抗炎和抗氧化方面[32, 33]。因此，本研究采用逐级提取法分离化学组成、单糖谱和分子量差异显著的多糖组分，从而获得多样化的样品，以系统阐明结构特征与抗AD活性之间的关系。

提取溶剂的选择直接决定多糖的结构特征和功能性质。传统的热水提取法因其简便性和环境可持续性而得到广泛应用。此外，盐水、酸性和稀碱溶液因其在温和条件下破坏细胞壁，从而提高多糖的提取率而被广泛使用[34, 35]。研究表明，通过传统热水提取和碱提取获得的苦瓜多糖在单糖组成、分子量分布和抗氧化活性方面存在显著差异[36]。在一项研究中，采用逐级溶剂提取法从黄麻中分离出四种多糖组分，评估了黄麻来源多糖组分的结构特征、功能性质和抗氧化能力，以生产具有可调功能的糖组分[35]。关于广西莪术多糖（GYJPs）的研究仍然十分有限。既往研究仅依赖于单步热水提取[37]，忽视了采用替代方法提取具有特定生物活性的结构多样化多糖组分的潜力。

本研究（如图1所示）采用逐级溶剂提取（水、0.05 M反式-1,2-环己烷四乙酸（CDTA）、0.05 M碳酸钠（Na?CO?）和0.1 M氢氧化钠（NaOH））从广西莪术中分离出四种不同的多糖组分（分别标记为GYJ-W、GYJ-C、GYJ-Na和GYJ-0.1 M）。并采用高效液相色谱（HPLC）、高效尺寸排阻色谱联用多角度激光光散射和折光率（HPSEC-MALLS-RI）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、核磁共振（NMR）光谱、扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）和热重分析（TGA）系统表征了多糖的物理化学性质（单糖组成、分子量、三螺旋构象、FT-IR光谱、UV-Vis光谱、NMR光谱、微观结构和热稳定性）。此外，还评估了其在氯化铝（AlCl?）诱导的小鼠AD样表型模型中的神经保护作用，重点关注运动功能恢复、神经元凋亡和潜在机制（胆碱能系统调节、抗炎和抗氧化活性）。本研究填补了广西莪术多糖结构和功能表征的空白；验证了提取方法、结构特征和抗AD活性之间的关系；并为开发基于天然多糖的AD治疗药物奠定了基础。

材料与化学试剂

广西莪术（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang）购自亳州万振中药饮片厂（安徽，中国），并由江苏康缘药业股份有限公司周吴教授鉴定。标本（编号YP2025039601）存放于中药制药过程控制与智能制造国家重点实验室。

成体野生型小鱼（AB品系）购自上海景实验室。

得率、化学成分和单糖组成

表1展示了从广西莪术中分离的四种多糖的得率、总碳水化合物含量、总糖醛酸含量和总蛋白含量。总得率为9.95%，显著高于传统单步水提取法所得得率[33]。四种GYJPs的得率排序为GYJ-0.1 M（4.49±0.19%）> GYJ-W（3.71±0.28%）> GYJ-Na（1.23±0.19%）> GYJ-C（0.52±0.05%）（P < 0.05），其中GYJ-0.1 M得率最高。

结论

在本研究中，我们采用水（GYJ-W）、0.05 M CDTA（GYJ-C）、0.05 M Na?CO?（GYJ-Na）和0.1 M NaOH（GYJ-0.1 M）逐级提取，分离了四种广西莪术多糖，并系统研究了它们的物理化学性质和抗AD活性。结果表明，提取方法可显著调控多糖的得率、化学组成、单糖组成、分子量和表面形态，而未对其高级结构造成实质性改变。

CRediT作者贡献声明

Fan Xiling：可视化、验证、方法学、调查研究、数据整理、概念设计。Li Juan：监督指导、方法学。Ma Manjiao：形式分析、数据整理。Li Ruoxi：验证。Jiang Jiaen：验证、软件。Yang Li：验证、软件。Liu Wenjun：监督指导。Wang Zhenzhong：监督指导。Cao Liang：监督指导。Li Haibo：监督指导、方法学、形式分析。Xiao Wei：监督指导、项目管理、方法学、资金获取。

利益冲突声明

作者声明与本文发表不存在利益冲突。

致谢

本研究得到中药制药过程控制与智能制造国家重点实验室目标项目（编号SKL2023D01001）及江苏省院士工作站（编号BM2024101和BM2023118）的资助。

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