《International Journal of Biological Macromolecules》：Controlling solubility of regenerated silk with additive assisted spray drying
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摘要专业翻译
喷雾干燥是制备再生丝素蛋白（regenerated silk fibroin，RSF）粉末的一种有前景的方法；然而，干燥过程往往促进β-折叠（β-sheets）的形成，这限制了粉末的溶解度并影响下游应用。本研究考察了三种常用赋形剂——麦芽糊精（m
摘要专业翻译
喷雾干燥是制备再生丝素蛋白（regenerated silk fibroin，RSF）粉末的一种有前景的方法；然而，干燥过程往往促进β-折叠（β-sheets）的形成，这限制了粉末的溶解度并影响下游应用。本研究考察了三种常用赋形剂——麦芽糊精（maltodextrin）、阿拉伯胶（gum arabic）和海藻糖（trehalose）——在干燥过程中影响丝素蛋白自组装的能力，从而制备出高溶解度粉末。与溶解度约为67%的纯喷雾干燥丝素蛋白相比，添加赋形剂在不改变粉末形貌的前提下提高了溶解度。麦芽糊精和阿拉伯胶分别将溶解度提高至77%和80%，但这些添加剂含量较高时会导致溶解度略有下降。相比之下，海藻糖在所有浓度下均能提高溶解度，在40% w/w海藻糖时达到近乎完全溶解（97%）。红外光谱（infrared spectroscopy）显示，麦芽糊精和阿拉伯胶在超过其最适水平后增加了β-折叠含量，而海藻糖在所有浓度下均逐步减少了β-折叠的形成。这可能归因于海藻糖分子尺寸较小，使其能够在干燥过程中与丝素蛋白链形成氢键并构建保护性水化壳层。据研究人员所知，这是首次证明海藻糖能在水性喷雾干燥过程中抑制再生丝素蛋白中β-折叠的形成。开发高溶解度的丝素蛋白-海藻糖粉末为RSF提供了一种潜在的可稳定储存形式。这些粉末在药物制剂中具有应用潜力，也可作为通过压缩成型或3D打印进行大宗材料生产的原料。
论文解读
一、研究背景与目的
丝素蛋白（silk fibroin）来源于家蚕（Bombyx mori）茧，是一种结构蛋白，含有结晶性β-折叠区域和较为柔性的无定形区域。这种独特结构赋予其机械强度和弹性，加之丝素蛋白良好的生物相容性，使其成为制药和生物医学领域有前景的生物材料。再生丝素蛋白（RSF）通常通过将脱胶丝纤维溶解于离液盐溶液并透析去除盐分获得。然而，RSF溶液本质上不稳定，温度、pH或机械应力的变化均可触发构象转变，促进聚集和β-折叠的逐步形成，最终导致不可逆凝胶化。即使在温和环境条件下，这种自发凝胶化的倾向仍是丝素材料储存、运输和大规模加工的主要限制。
为克服这一问题，研究人员提出将RSF转化为干燥粉末以改善操作便利性并支持下游加工。喷雾干燥因其连续、可规模化且兼容水性丝素溶液的特点，在粉末制备方法中尤为具有吸引力。然而，喷雾干燥使用热量，可能促进分子间缔合和β-折叠形成，产生溶解度有限的半结晶粉末，从而限制进一步加工。在其他蛋白质体系中，与糖类和多糖类添加剂共喷雾干燥被广泛用于抑制干燥过程中的结晶化并通过减少蛋白质-蛋白质相互作用来增强溶解度。尽管如此，这些添加剂对RSF在水性喷雾干燥过程中二级结构和溶解度的比较性影响仍缺乏深入了解。
本研究旨在通过将RSF与三种常见赋形剂——麦芽糊精、阿拉伯胶和海藻糖——共喷雾干燥来改善溶解度和分子稳定性。这些添加剂代表了不同的赋形剂类别，包括小分子糖（海藻糖）、大分子多糖（麦芽糊精）和异质天然提取物（阿拉伯胶）。通过系统改变添加剂浓度，研究探讨了其对粉末形貌、溶解度和β-折叠形成的影响。
二、主要技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：利用SDS-PAGE分析再生丝素蛋白的分子量分布；采用扫描电子显微镜（SEM）观察粉末形貌；使用激光衍射粒度仪（Mastersizer 3000）测定粒径分布；利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）结合酰胺I区去卷积和曲线拟合定量分析蛋白质二级结构；采用X射线衍射（XRD）评估粉末结晶性；使用热重分析（TGA）测定粉末水分含量；通过溶解度测试量化丝素蛋白溶解百分比；利用圆二色光谱（CD）分析再溶解粉末的二级结构。丝素蛋白溶液制备采用180 min碱法脱胶（3 g L-1 Na2CO3，98 °C），随后以9.3 M LiBr溶解并经3.5 kDa截留分子量透析膜透析72 h。
三、研究结果
3.1 丝素蛋白分子量分布
SDS-PAGE分析显示，180 min的长时间脱胶处理（3 g L-1 Na2CO3，98 °C）导致显著的丝素蛋白降解。在约315 kDa至183 kDa区域观察到较致密的染色带，代表391 kDa重链的降解片段；在接近25 kDa处也检测到较致密区域，可能反映25.8 kDa轻链和25.1 kDa P25蛋白的降解残余。这一模式表明碱性处理过程中丝素蛋白发生显著水解，碎裂为较低分子量的较小肽段。因此，后续所有喷雾干燥试验均采用低分子量丝素蛋白。
3.2 添加剂对丝素颗粒形貌的影响
纯麦芽糊精和纯阿拉伯胶均形成形态良好、表面光滑的球形颗粒。纯海藻糖未能形成稳定颗粒，呈现部分熔融或融合的形态，这是吸湿性玻璃态糖类的典型特征。纯丝素样品呈现喷雾干燥蛋白质特有的不规则、皱缩、塌陷颗粒形态，内部中空。当丝素与添加剂（5–40% w/w）共喷雾干燥时，颗粒形貌与纯丝素相比基本保持不变。粒径分析确认所有丝素-添加剂配方的体积中位径（D50）约为8–10 μm，与纯丝素（D50为9 μm）相当，表明添加剂在不同浓度下均未显著影响颗粒尺寸。Span值范围为1.73至2.69，表明粒径分布中等偏宽，符合喷雾干燥粉末的典型特征。
3.3 二级结构分析
FTIR分析显示，与纯丝素相比，含添加剂的丝素样品β-折叠含量降低，酰胺I区发生相应位移。纯丝素的β-折叠含量为38%。麦芽糊精配方中，5% w/w MD的β-折叠含量与纯丝素相近（38.1%），随浓度增加至20%时降至35%，40%时略回升至36%，但大多数MD配方与纯丝素无显著差异。阿拉伯胶配方中，5% GA与纯丝素无显著差异，10–40% GA配方的β-折叠含量显著低于纯丝素（约34.8–35.5%）。海藻糖的影响最为显著：40%海藻糖配方的β-折叠含量降至31%，是所有样品中最低的，且与纯丝素和较低海藻糖浓度相比均具有统计学显著差异。值得注意的是，β-折叠含量并未在更高添加剂浓度下回升，这与MD和GA的行为形成对比。海藻糖的较强效果可归因于其二糖结构：较小的分子尺寸使其能够与丝素蛋白链形成氢键并在干燥过程中构建保护性水化壳层，而较大的多糖则因流动性降低和氢键形成能力减弱而效果有限。
3.4 X射线衍射分析
所有样品的XRD图谱均在2θ = 20°处呈现宽峰，这是无定形丝素蛋白的典型特征，对应与低有序堆积相关的丝素I结构。尽管FTIR显示31–38%的β-折叠含量，但XRD未检测到尖锐衍射峰，表明喷雾干燥产生了主要为无定形的丝素颗粒。β-折叠结构域可能以纳米晶或短程有序形式存在，尺寸过小或有序度不足而无法产生清晰衍射峰。添加剂的掺入未产生新峰或改变峰位，表明这些添加剂保持无定形状态且未促进丝素结晶化。
3.5 粉末水分含量与蛋白质溶解度
喷雾干燥粉末的水分含量范围为9.2%至11.9%。纯丝素水分含量为11.9%，含海藻糖的配方水分含量较低（9.2–10.5%），含麦芽糊精和阿拉伯胶的样品在9.7%至11.7%之间变化。较低的水分含量可能提高玻璃化转变温度（Tg）并降低分子迁移率，有助于防止储存期间聚集和β-折叠形成。
溶解度测试显示，纯喷雾干燥丝素的溶解度为66%（摘要中报告约67%）。所有麦芽糊精配方的溶解度均显著高于纯丝素，从5% MD时的69%升至20% MD时的77%，40% MD时略降至74%。阿拉伯胶配方的溶解度随含量增加而提高，20% GA时达到最高值，40% GA时出现显著下降。海藻糖对溶解度的影响最为显著：所有海藻糖配方的溶解度均显著高于纯丝素，从5%时的85%升至20%时的97%，20%与40%之间无显著差异。海藻糖的优先水化机制（preferential hydration）可防止黏附和聚集，抑制β-折叠形成，并保持丝素蛋白的水化和完整性。
3.6 圆二色光谱分析
CD光谱分析显示，纯丝素的再溶解部分呈现约217 nm处的负带和约192 nm处的明显正带，表明富含高度有序的β-折叠结构。添加20% MD、20% GA和40% T后，217 nm处负带强度降低，表明β-折叠含量下降、无序构象（如无规卷曲和无定形结构）增加。尽管含添加剂样品的β-折叠丰富度低于纯丝素，但其光谱仍保留192 nm和217 nm处的特征峰，表明存在部分有序结构域。丝素结构并未完全改变，而是变得更加柔性和更少结晶性。CD结果与FTIR分析一致，并与各配方溶解度的提高相关联。
四、讨论与结论
海藻糖对喷雾干燥丝素蛋白的稳定化可通过蛋白质-糖相互作用的成熟模型解释，包括水置换机制（water replacement）、优先排斥机制（preferential exclusion）和玻璃化机制（vitrification）。在水置换机制中，碳水化合物中的羟基与丝素蛋白主链上的极性基团形成氢键，替代通常维持蛋白质结构稳定的水分子，使蛋白质在喷雾干燥等脱水过程中保持构象。在优先排斥过程中，糖类因热力学驱动力被排除在蛋白质表面之外，提高未折叠态的自由能，从而有利于折叠态和更稳定的蛋白质构象。此外，糖类干燥后形成无定形玻璃态基质，限制蛋白质链的移动，减少分子重排或聚集风险。海藻糖作为高亲水性二糖，含有大量羟基，能与丝素蛋白中的酰胺（–CONH–）和羟基形成强氢键。分子动力学研究表明，海藻糖与蛋白质主链羰基和酰胺基形成持久氢键网络，在脱水过程中替代水分子并稳定蛋白质构象。这些相互作用破坏了丝素-丝素间的缔合，限制了β-折叠晶体的形成，从而将丝素分子保持在更无序、易于再水化的状态，增强了溶解度。
相比之下，麦芽糊精是显著更大的多糖，阿拉伯胶是含糖蛋白和多糖混合物的提取物。这些较大分子与海藻糖相比流动性和柔韧性降低，与丝素链表面强相互作用的能力减弱，使得丝素-丝素相互作用增强，β-折叠生成增加。在高碳水化合物浓度下，丝素蛋白与碳水化合物添加剂之间扩散速率的差异可能导致液滴干燥过程中的组分偏析，形成蛋白质富集区和碳水化合物富集区，影响粉末的水化动力学和溶解行为。
研究人员指出，含海藻糖配方虽能增强丝素溶解度，但添加剂的使用可能影响丝素在生物医学应用中的生物相容性。大量糖类可能改变间质渗透压，若材料在体内使用可能对周围组织造成局部损伤。该影响取决于具体应用场景。对于大宗材料开发等用途，应在设计过程中考虑糖类的掺入，必要时可采用水浸泡等后处理策略去除残余糖类。海藻糖也常被用作生物相容性冷冻保护剂和药用赋形剂，加工后残余量不太可能引起毒性。未来研究应评估添加剂浸出、渗透压及添加剂改性丝素的细胞相容性，以确认其在生理应用中的适用性。
综上所述，本研究首次证明海藻糖能在水性喷雾干燥过程中抑制再生丝素蛋白中β-折叠的形成。开发高溶解度的丝素蛋白-海藻糖粉末为RSF提供了一种潜在的可稳定储存形式，这些粉末在药物制剂中具有应用潜力，也可作为通过压缩成型或3D打印进行大宗材料生产的原料。
