西班牙鼠尾草（Salvia hispanica L.）WRKY转录因子家族的首个全基因组鉴定、进化特征及mRNA表达谱计算机模拟研究

《Discover Plants》：Genome wide identification and in silico mRNA expression profiling of the WRKY transcription factor gene family in Salvia hispanica

　　

本研究首次对唇形科（Lamiaceae）营养作物西班牙鼠尾草（Salvia hispanica L.；chia）的WRKY转录因子（transcription factor, TF）基因家族开展综合性的计算机模拟（in silico）全基因组鉴定、表征及mRNA表达谱分析。研究人员从chia参考基因组中鉴定出35个CsWRKY基因，并依据WRKY结构域数目和锌指基序类型将其分为7个系统发育组（I、IIa–IIe、III）。平均蛋白长度为332.8 aa，平均分子量为37,499 Da，平均等电点为7.62；蛋白长度与分子量几乎完全相关（r = 0.9995）。亚细胞定位预测显示其主要分布于细胞核和细胞质。基因结构分析显示含2–7个外显子，MEME鉴定出15个保守基序，包括不变的WRKYGQK七肽。片段重复占主导，并在纯化选择下进化。启动子分析检测到20类顺式作用调控元件，最大似然系统发育树（maximum-likelihood phylogeny）将CsWRKY与来自Arabidopsis thaliana、Oryza sativa、Glycine max、Medicago truncatula和Physcomitrella patens的同源蛋白聚类。计算机模拟表达谱分析仅使用经验证的公开S. hispanica RNA-Seq（RNA sequencing）数据集，因此仅限于组织特异性和发育模式；由于目前尚无chia非生物胁迫RNA-Seq数据集，未进行胁迫响应表达分析。研究人员构建同源模型（homology models）并进行对接，计算机模拟预测鉴定CsWRKY3为最强结合者。这些计算机模拟预测提供了初步的基因组框架，需未来实验验证，并可能指导chia中WRKY介导过程的研究。

研究背景与问题：西班牙鼠尾草（Salvia hispanica L.；chia）为唇形科（Lamiaceae）一年生草本，种子富含ω-3 α-亚麻酸、优质蛋白、可溶性膳食纤维和抗氧化成分。其参考基因组已组装为6条假染色体（2n=2x=12；约347.6 Mb；31,069个蛋白编码基因），为功能基因组研究提供资源。WRKY转录因子（transcription factor, TF）是植物最大TF家族之一，含一个或两个保守WRKY结构域、WRKYGQK七肽和锌指基序（C₂H₂或C₂HC），通过结合W-box（TTGACC/T）调控防御、非生物胁迫、衰老和发育。尽管A. thaliana（74）、O. sativa（109）等已有全基因组WRKY分析，chia尚缺WRKY家族全基因组表征，故研究人员开展首个in silico全基因组鉴定、表征和表达谱研究以填补空白。研究人员鉴定35个CsWRKY并分为7组，分析其结构、复制、启动子、系统发育、组织表达并开展同源建模与对接；结论为chia WRKY以片段重复为主并在纯化选择下进化，表达呈组织偏好，CsWRKY3为最强apigenin结合候选；意义在于建立chia WRKY基因组框架并优先候选基因，但所有结果为计算预测，需实验验证。

关键技术方法（≤250字）：基于Wang et al. (2022)的S. hispanica染色体级参考基因组，以TAIR、RGAP和NCBI的A. thaliana、O. sativa、G. max、M. truncatula、P. patens WRKY蛋白行BLASTp，经Pfam PF03106、SMART和Batch CD-Search确认。用ProtParam、CELLO/WoLF PSORT/DeepLoc、GSDS 2.0、MEME/TBtools、Clustal Omega/ESPript、PAL2NAL、SOPMA、MEGA7（ML，JTT+G，1000 bootstrap）、PlantCARE分析。表达分析仅用公共RNA-Seq队列：PRJEB19614（13组织，三重复，HiSeq 2500）、PRJNA597830（叶/根三重复，HiSeq 4000）、PRJNA196477（种子3、7、14、21、28 DAF），经Trimmomatic、HISAT2、featureCounts量化。同源建模/对接用I-TASSER、PROCHECK、ERRAT、AutoDock v4.2；统计用R v4.3.0。

研究结果：
3.1 鉴定与分类：同源检索获得35个全长WRKY基因（CsWRKY1–CsWRKY35），均含PF03106 WRKY域和锌指基序并经SMART/Pfam/CD-Search确认；12个属I组（双WRKY域；C₂H₂），15个属II组（单域；C₂H₂；IIa–IIe），8个属III组（单域；C₂HC）。蛋白143–606 aa，均值332.8 aa；分子量（molecular weight, MW）均值37,499 Da；等电点（isoelectric point, pI）均值7.62（5.16–9.67）；GRAVY均负，脂肪族指数均值76.25。
3.2 亚细胞定位：WoLF PSORT、DeepLoc和CELLO预测18个（51.4%）主要定位于细胞核，14个（40.0%）定位于细胞质，3个定位于叶绿体。
3.3 基因结构与保守基序：GSDS 2.0显示2–7个外显子；I组结构较复杂（4–7个外显子），IIa/IIb组多为两外显子/一内含子；MEME鉴定15个基序，Motif 1为核心WRKY域（WRKYGQK，35个蛋白均含），Motif 2为I/II组C₂H₂，Motif 3为III组C₂HC，Motif 4–5为I组第二WRKY域。
3.4 染色体分布与基因复制：35个基因不均匀分布于6条染色体（chr1 7、chr2 5、chr3 12、chr4 3、chr5 5、chr6 3）；鉴定16对重复（13对片段重复、3对串联重复）；全部Ka/Ks<1（0.207–0.642，均值0.4176），显示纯化选择（purifying selection），无正选择证据；平均分歧时间23.05±13.54 Mya。
3.5 二级结构：SOPMA显示α-螺旋为主（均值41.65%），其次为无规卷曲（38.56%）、延伸链（13.38%）和β-转角（6.41%）；延伸链对应WRKY域W-box结合面的四链β-片层。
3.6 系统发育：MEGA7最大似然（maximum likelihood, ML；JTT+G；1000 bootstrap）将35个CsWRKY与5个参考物种直系同源物解析为7个WRKY组；I组和II组最大；多数CsWRKY与真双子叶植物同源物聚类而非单子叶O. sativa，符合chia在唇形科中的系统位置。
3.7 启动子顺式调控元件：PlantCARE分析2000-bp启动子鉴定20类顺式作用调控元件（cis-acting regulatory element, CARE）；富集W-box、MYB结合位点、STRE、TC-rich repeats、ABRE、ERE、GARE、TGA和TCA-element，并含光响应和昼夜元件，提示CsWRKY参与激素与环境信号整合。
3.8 计算机模拟组织特异表达谱：基于公共RNA-Seq（PRJEB19614、PRJNA597830、PRJNA196477）分析根、茎、叶、花、种子表达（三生物学重复均值±SD）；多数CsWRKY呈组成型表达并具组织偏好；单因素方差分析（one-way ANOVA）显示组织间表达差异显著（p<0.05）；因无chia非生物胁迫RNA-Seq数据，未分析胁迫响应表达。
3.9 统计分析：蛋白长度与MW几乎完全相关（Pearson r=0.9995，p<0.0001，n=35）；Ka/Ks单样本t检验确认重复对受强纯化选择（均值0.4176，p<0.0001）；ANOVA显示组织表达差异显著（p<0.05）；pI分布符合正态（Shapiro–Wilk，p>0.05）；主成分分析（principal component analysis, PCA）前两成分分离组织偏好模式。
3.10 同源建模与分子对接：每组一个代表CsWRKY经I-TASSER建模并验证，TM-score 0.72–0.90，Ramachandran favored区域残基比例均>89%；与apigenin（PubChem CID 5280443）对接预测所有代表在WRKY域裂隙结合，CsWRKY3结合自由能（binding free energy, ΔG）最低（?7.00 kcal/mol），CsWRKY17最弱；该对接为探索性结构假设，需ITC或荧光结合等实验确认。

讨论总结：讨论部分明确所有发现均为in silico预测，需实验验证。35个CsWRKY与紧凑、非重复的chia基因组相符，低数并非注释不全；类群一致的 phylogeny、组相关结构和严格保守基序支持分类。复制以片段重复为主，16对均Ka/Ks<1，显示纯化选择，未声称正选择。启动子富集ABRE、MYB、W-box、STRE提示激素/胁迫信号网络；公共转录组组织偏好表达提示发育角色，但为相关性和预测性。apigenin对接为探索性结构假设，基于其自然存在和WRKY参与胁迫与次生代谢调控，需实验验证。局限包括全计算无湿实验、无胁迫RNA-Seq、仅8/35代表建模、使用预测结构、算法估计及单参考基因组未捕获品种变异。
结论翻译：一项综合计算机模拟调查在chia中鉴定出35个WRKY基因，将其分为7组，并仅使用经验证的公共数据集表征其结构、基序、染色体组织、复制、启动子、二级结构、系统发育和组织特异性表达。该家族在纯化选择下进化，经验证的同源模型与apigenin对接提名CsWRKY3为感兴趣候选。所有发现均为计算预测，提供初步框架，以指导而非替代未来对Salvia hispanica中WRKY功能的实验表征。