《Oncogene》：Glioma-derived ULBP2 triggers microglial extracellular traps formation via PAD4 lactylation to drive autophagy-dependent malignant growth
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胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）中可出现小胶质细胞胞外诱捕网（microglial extracellular traps, MiETs），但其潜在分子机制与功能尚不明确。本研究旨在探讨GBM来源的UL16结合蛋白2（U
胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）中可出现小胶质细胞胞外诱捕网（microglial extracellular traps, MiETs），但其潜在分子机制与功能尚不明确。本研究旨在探讨GBM来源的UL16结合蛋白2（UL16-binding protein 2, ULBP2）激活MiETs并操纵小胶质细胞支持GBM发展的能力。本研究发现ULBP2是GBM中显著上调的关键蛋白，并可触发MiETs形成；而MiETs反过来加速GBM的恶性生长。在机制上，GBM释放ULBP2与小胶质细胞上的多配体蛋白聚糖-1（syndecan-1, SDC1）结合，ULBP2/SDC1复合物诱导肽基精氨酸脱亚氨酶4（peptidylarginine deiminase 4, PAD4）发生乳酸化修饰，进而促进MiETs形成。此外，MiETs可刺激GBM自噬，从而促进其增殖与侵袭。研究结果表明，GBM通过ULBP2/SDC1/PAD4-乳酸化轴在MiETs形成中发挥关键作用，且GBM与小胶质细胞之间的相互作用形成了促进肿瘤进展的正反馈机制。因此，这些数据为靶向MiETs以预防和抑制GBM提供了潜在治疗靶点的新见解。
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑肿瘤，尽管采用手术切除、放化疗及肿瘤电场治疗等多模式治疗，患者中位生存期仍不足15个月。其治疗的主要障碍源于动态变化的肿瘤微环境（TME），肿瘤细胞与周围基质细胞的相互作用构筑了GBM的网络架构，导致肿瘤恶性程度增加。小胶质细胞作为中枢神经系统中的常驻巨噬细胞，占脑细胞总数的10%以上，是TME中主要的非肿瘤细胞成分，在GBM发生和进展中发挥关键作用。以往研究发现GBM可操纵小胶质细胞促进肿瘤生长，且小胶质细胞能够产生胞外诱捕网（MiETs），其形成过程与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）类似，由肽基精氨酸脱亚氨酶4（PAD4）催化，形成由游离DNA、髓过氧化物酶（MPO）、瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）及基质金属蛋白酶等聚合而成的典型结构。虽然已在GBM中证实MiETs的存在，但其形成的分子机制及在GBM进展中的作用仍缺乏深入研究。UL16结合蛋白2（ULBP2）作为自然杀伤细胞2族成员D配体（NKG2DL）之一，在多种癌症中高表达，且胶质瘤细胞优先释放可溶性ULBP2，但其对胶质瘤恶性转化的功能尚不明确。本研究旨在阐明GBM来源的ULBP2对MiETs形成的调控作用及其促进肿瘤生长的分子机制，为GBM治疗提供新靶点。
研究人员首先通过生物信息学分析、临床标本检测和细胞实验确认ULBP2在GBM中高表达且与恶性分级及不良预后相关。利用慢病毒转染敲低GBM细胞中ULBP2表达，制备条件培养基（CM）处理小胶质细胞，并通过免疫荧光（IF）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质印迹（WB）和免疫共沉淀（Co-IP）等技术，系统解析ULBP2/SDC1/PAD4乳酸化轴对MiETs形成的调控作用。随后通过CCK-8、Transwell实验和颅内异种移植瘤模型评估MiETs对GBM增殖、侵袭及自噬的影响。研究使用了来自TCGA数据库的619例胶质瘤RNA-seq数据及104例临床石蜡标本（39例II级、31例III级、34例IV级），并采用PLX5622清除小胶质细胞、GSK484抑制PAD4、氯喹（CQ）抑制自噬、雷帕霉素诱导自噬等工具进行机制验证。
研究结果部分包括以下内容：第一，“Upregulation of ULBP2 in glioma”部分：TCGA数据库分析显示ULBP2 mRNA水平与胶质瘤组织学分级正相关，且高表达ULBP2患者总生存期缩短；104例临床标本免疫组化（IHC）结果与数据库一致；GBM细胞系（U87、U251）中ULBP2蛋白表达及分泌水平均高于人星形胶质细胞（HA）。第二，“Glioma releases ULBP2 to promote MiETs”部分：将HMC3小胶质细胞与GBM细胞共培养后，MPO与CitH3共定位增加，MPO-DNA复合物释放增多；敲低ULBP2可抑制MiETs形成，外源重组ULBP2蛋白可部分恢复；体内实验证实ULBP2敲低减少TME中CitH3?TMEM119?小胶质细胞比例，补充ULBP2可逆转；经PLX5622清除小胶质细胞后，Ly6G?中性粒细胞形成的NETs极少，表明ULBP2主要诱导MiETs而非NETs。第三，“ULBP2/SDC1 complex induces PAD4-Kla in microglia”部分：His标记的ULBP2可与小胶质细胞表面SDC1结合，Co-IP证实二者直接互作；ULBP2/SDC1复合物上调糖酵解相关蛋白PKM2和LDHA表达，增加细胞内L-乳酸水平，并促进PAD4的赖氨酸乳酸化修饰（PAD4-Kla）；敲低SDC1或使用SDC1抑制剂Indatuximab可削弱上述效应。第四，“ULBP2/SDC1/PAD4-Kla axis activates MiETs”部分：抑制SDC1可阻断ULBP2诱导的PAD4-Kla和MiETs，外源L-乳酸可恢复；PAD4抑制剂GSK484再次抑制L-乳酸触发的PAD4-Kla和MiETs；体内实验同样验证了该信号轴对MiETs形成的必要性。第五，“ULBP2-induced MiETs accelerate GBM growth”部分：单独敲低ULBP2仅轻微降低GBM细胞活力而非侵袭力；但ULBP2诱导的MiETs显著促进GBM细胞活力和侵袭，DNase I降解MiETs后这些作用减弱；不同CM处理的小胶质细胞实验表明，ULBP2敲低来源的CM不能有效促进GBM恶性生长；颅内模型中ULBP2敲低使肿瘤体积减小和Ki67阳性率降低，外源ULBP2可逆转，GSK484则再次抑制。第六，“MiETs-mediated malignant progression of GBM was related to autophagy”部分：MiETs上调GBM细胞中Beclin-1表达及LC3-II/LC3-I比值，并增强LC3斑点聚集；自噬抑制剂CQ可削弱MiETs促进的增殖和侵袭；体内实验中，PLX5622或GSK484减少Ki67阳性率，而雷帕霉素诱导自噬可恢复其促进作用。
讨论部分指出，尽管多种ETs已被发现并报道可促进肿瘤进展，但GBM与ETs之间的相互作用研究甚少。本研究证实ULBP2在GBM中过表达，且TCGA数据库支持ULBP2随分级升高而增加的结果。ULBP2通过与小胶质细胞SDC1结合，上调糖酵解酶和乳酸水平，促使PAD4发生乳酸化，进而驱动MiETs形成。MiETs作为整体激活GBM自噬，促进肿瘤增殖和侵袭，形成GBM与小胶质细胞之间的正反馈循环。研究仍存在局限：外周巨噬细胞可迁移至GBM并产生巨噬细胞胞外诱捕网（METs），体内难以完全区分小胶质细胞与巨噬细胞，MiETs与METs的功能异同尚不明确；此外，MiETs中何种分子通过自噬途径促进GBM侵袭尚未鉴定。结论部分翻译如下：总体而言，研究人员证实GBM与小胶质细胞之间的串扰通过ULBP2/SDC1/PAD4-乳酸化轴触发MiETs，而MiETs以自噬依赖方式增强GBM生长。该发现支持靶向TME中ULBP2起源的正反馈通路将成为预防和治疗GBM的重要策略。
