p97–Ufd1-Npl4–FAF1加工泛素化底物的结构动态与协同机制

《Nature Communications》：Structural dynamics of substrate processing by the p97-Ufd1-Npl4-FAF1 machinery

　　

AAA-ATPase VCP/p97（含缬酪肽蛋白）在关键信号传导和细胞稳态通路中使泛素化蛋白去折叠，但Ufd1-Npl4（UN）和FAF1（Fas-associated factor 1）适配器如何处理泛素链以协调底物装载与加工仍不清楚。研究人员的冷冻电镜（cryo-EM）研究显示，p97-UN与FAF1结合底物时揭示驱动底物加工的相互作用。Npl4被远端泛素（ubiquitin，Ub）覆盖，起始泛素可从Npl4凹槽追踪至ATPase通道并达到近原子分辨率；研究发现Npl4塔可适应性响应ATPase马达螺旋阶梯的构象变化。FAF1中的一段螺旋与Ufd1-UT3结构域共同结合近端泛素，同时提供必要的结构可塑性以容纳该运动并将泛素递送至Npl4凹槽。该研究揭示了p97、UN与FAF1在高效加工泛素化底物过程中的复杂动态互作。

p97/VCP（valosin-containing protein，含缬酪肽蛋白）是保守的AAA+ ATPase（ATPases Associated with various cellular Activities，与多种细胞活动相关的ATP酶），通过ATP水解驱动多泛素化底物重塑或去折叠，参与蛋白和细胞器清除、自噬、线粒体蛋白降解、DNA损伤修复及内质网相关降解等过程；其点突变与多系统蛋白病-1相关，并在部分癌症中上调。p97形成六聚体，每个原体含N端结构域（NTD）及D1、D2两个ATPase结构域，呈螺旋阶梯构象，并以“手递手”机制转位底物。Ufd1-Npl4（UN）是泛素化底物的主要适配器，Npl4以塔状位于p97的D1孔上方，起始泛素在Npl4疏水槽去折叠并插入D1孔。然而，Npl4与D1环及ATPase N端交替界面所形成的构象及其与p97亚基顺序运动如何协调仍不清楚；远端泛素帽接Npl4，但剩余泛素链、Ufd1的UT3结构域及底物穿线持续性的结构机制亦不明确。哺乳动物p97-UN还需FAF1等辅助适配器高效处理泛素化底物；FAF1含UBA、UAS和UBX等结构域，预测其与Ufd1的UT3及泛素链结合，但高分辨结构及其如何与Npl4相对p97螺旋运动协调尚缺。为此，研究人员开展本研究，论文发表于《Nature Communications》。研究人员体外重构p97（A232E，E578Q）-UN-FAF1变体与K48多泛素化Ub_n-Eos底物复合物，以ADP·BeF_x锁定早期预水解状态，开展大规模冷冻电镜（cryo-EM）分析，获得四个状态；最高分辨State II中p97与UN达3.1 ?，FAF1平均8 ?。研究揭示单个FAF1与UN协同结合并加工多泛素化底物，FAF1作为锚杆限制UN旋转同时允许其适应ATPase螺旋阶梯动态，为理解p97适配器协同调控蛋白质量控制与降解提供机制基础。关键技术方法概括：本研究无临床样本队列，Ufd1/Npl4开放阅读框来源于HeLa cDNA；主要采用体外重组蛋白复合物重构、冷冻电镜约280,000 movies采集与多状态分类及局部精修、荧光去折叠功能实验、质量光度法、生物素化pull-down、AlphaFold3结构预测及三维变异性分析。
研究结果如下。“底物接合状态下p97与Ufd1-Npl4及FAF1 C端结构域复合物的整体架构”：通过体外重构与冷冻电镜分析，研究人员获得底物接合复合物整体架构，Npl4倾斜锚定于D1，起始泛素密度连续延伸至D2环，三个泛素帽接UN塔；每个p97六聚体仅一个FAF1，其UBX结合与Npl4相对的NTD，C端螺旋指向UN塔上方泛素并接触UT3。“起始泛素”：通过近原子密度建模与功能突变，研究人员追踪起始泛素从Npl4凹槽至D2环，Npl4 β-发夹425-439稳定泛素螺旋，T22/I23嵌入互补口袋；D1孔环K277与底物负电残基互作，D2孔环M550/W551/F552主要与骨架形成氢键；破坏Npl4凹槽互作的E446K+Y447A显著损害底物去折叠。“Npl4与p97的相互作用”：通过局部密度分析，研究人员发现Npl4以ZF-2的W200/I204/T206插入D1亚基B疏水槽，ZF-1进入亚基D的NTD疏水口袋，形成倾斜构型；并观察到另外三种Npl4构象状态。“D1环水平上FAF1与UN及p97的相互作用”：通过密度与局部精修，研究人员发现FAF1 UBX结合亚基A的NTD，邻近密度对应Ufd1 SHP box，L235结合NTD疏水槽，从而将UN与结合FAF1的同一NTD桥接，解释1:1:1化学计量。“FAF1与Ufd1协同参与多泛素化底物的结合和加工”：通过局部分类、AlphaFold3预测、位点突变及去折叠实验，研究人员发现FAF1 C端螺旋496-523与Ufd1 UT3及两个近端泛素结合，UT3与Ub(-1)和Ub(x)界面突变降低底物去折叠；破坏FAF1-UT3界面的V507A/K508A及删除C端螺旋相关片段均削弱FAF1增强p97/UN加工的功能；UAS结构域位于C端螺旋末端，未显示与Npl4或远端泛素直接互作。“p97底物加工过程中FAF1与UN的动态互作”：通过大规模分类、局部精修与三维变异性分析，研究人员解析四个状态，FAF1始终结合同一NTD，UN呈平面与倾斜构象；状态I→II中缝合亚基移至顶部，整体上移约26 ?并引起UN小幅构象变化；状态II→III中ZF-1界面破坏后结合新缝合亚基的NTD-D1沟槽，UN顺时针旋转约60°并抬高约20 ?，ZF-2解离，FAF1螺旋与UT3摆出约13°；状态III→IV中UN反向旋转约40°，ZF-1结合新缝合亚基，ZF-2结合反时钟相邻亚基NTD，UBXL随Npl4运动恢复位置；三维变异性分析显示FAF1、UT3与近端泛素存在连续构象轨迹。讨论部分总结：FAF1通过UBX与Ufd1 SHP box结合同一NTD，并通过C端螺旋招募UT3，加之多泛素链的系绳作用，共同约束UN整体方向而保留其适应性；Npl4在平面与倾斜状态间转换由缝合亚基触发，形成平面→旋转→倾斜-a→回旋→倾斜-b→平面的循环，FAF1螺旋呈摆入-摆出运动；FAF1将UT3定位至与Npl4顶部远端泛素相近的高度，形成近端泛素与远端泛素连续结合平台；UAS域可能作为辅助泛素结合平台，但尚需进一步研究；后续两个状态未被捕获，UN无限旋转不可行。研究结论翻译：研究人员的结构结果详细揭示了FAF1与UN如何结合多泛素化底物蛋白以供p97加工，并阐明p97、其适配器UN及辅助适配器FAF1在ATPase循环和底物加工中的动态协同互作，提供FAF1最终提高该过程效率的机制见解；鉴于p97-适配器复合物的组合多样性，该研究为未来理解不同p97辅助适配器和适配器如何协同ATPase马达调控其功能提供了范式与坚实基础。