淋巴 PD-L1 敲除增加增殖性 PD-1+ CD8+...

《Cancer Research Communications》：Lymphatic PD-L1 deletion increases proliferating PD-1+ CD8+...

　　

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摘要

淋巴结（LN）驻留淋巴管淋巴管内皮细胞（LEC）形成淋巴窦管腔与淋巴结皮质之间的界面。除了在白介质运输中的作用外，LEC还通过清除和交叉呈递来自输入淋巴液的外源性抗原以及组成性表达免疫调节蛋白（如PD-L1）来塑造免疫应答。然而，目前尚不清楚哪些免疫细胞类型和激活状态对淋巴结淋巴管PD-L1敏感，以及淋巴管PD-L1的表达是否与癌症患者的免疫检查点阻断（ICB）敏感性相关。为了剖析淋巴结淋巴管PD-L1对黑色素瘤肿瘤免疫和ICB预后的贡献，我们利用条件性淋巴管PD-L1敲除小鼠模型，结合不同ICB敏感性的同源黑色素瘤模型进行研究。尽管淋巴管PD-L1的缺失并未改变原发肿瘤的生长、进展或肿瘤引流淋巴结内的整体免疫格局，但它调节了ICB敏感而非ICB耐药黑色素瘤中的肿瘤内免疫组成。具体而言，淋巴管PD-L1的缺失导致增殖性PD-1+CD8+T细胞频率增加和PD-1+Th1T细胞减少。综上，我们的发现揭示淋巴管PD-L1在塑造抗肿瘤T细胞应答中发挥情境依赖性作用，尤其在ICB敏感的疾病中。

意义：作者将免疫检查点调控的概念扩展到肿瘤微环境中的免疫细胞之外，展示了在黑色素瘤引流淋巴结中的淋巴管内皮PD-L1如何调节ICB敏感黑色素瘤中的肿瘤浸润T细胞。

引言

免疫检查点阻断（ICB）最初旨在重新激活肿瘤微环境（TME）中的耗竭T细胞并恢复抗肿瘤效应功能（1）。然而，越来越多的证据表明，ICB不仅在TME内发挥作用，还产生区域性和系统性效应（2, 3）。特别是，肿瘤引流淋巴结（tdLN）已成为ICB治疗的关键作用部位。值得注意的是，在ICB治疗前对小鼠进行淋巴结切除术会使其治疗疗效消失，这突显了tdLN在介导治疗反应中的重要性（3, 4）。此外，将ICB局部给药至tdLN所产生的肿瘤控制效果与全身治疗相当或更优（5–7）。多项研究已鉴定出tdLN中的早期CD8+T细胞作为ICB的直接应答者（R）。这些细胞表达TCF1并保持强大的增殖和自我更新能力，从而产生大量TCF1+TOX+祖细胞耗竭T细胞（Tpex），随后迁移至TME（3, 8）。淋巴结由多样的免疫和基质细胞群组成，包括淋巴管内皮细胞（LEC）。有趣的是，LEC组成性表达免疫检查点蛋白如PD-L1（CD274），同时缺乏共刺激分子，提示其在周围耐受和免疫抑制中可能发挥作用（9–14）。淋巴结（LN）LEC组成性高表达PD-L1 mRNA，特别是在被膜下窦底（fLEC）和髓质窦（mLEC）亚群中，而外周LEC在稳态下不表达PD-L1，仅在炎症时上调（15–18）。由于其所在位置，LN LEC与迁移性和驻留性免疫细胞直接接触，包括巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞，可能影响广泛的免疫应答。我们此前已证明，淋巴管PD-L1抑制了具有CD44+CD62L+中央记忆表型的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞，这在ICB敏感的结直肠癌（MC38）和ICB耐药的黑色素瘤（B16-F10）小鼠模型中均有体现，表明LN LEC通过表达PD-L1促进肿瘤免疫逃逸（19）。然而，淋巴管PD-L1对tdLN和TME免疫格局的精确影响及其与肿瘤ICB应答性的关系尚不明确。此外，尽管小鼠和人类的LN LEC均表达PD-L1 mRNA，但人类tdLN LEC中PD-L1蛋白的存在尚未被研究。为回答这些问题，我们使用多重免疫染色证实PD-L1在人类黑色素瘤引流淋巴结的fLECs和mLECs中表达，且与ICB应答性相关，而被膜下窦（SCS）顶壁LEC（cLEC）则几乎或完全不表达PD-L1。此外，我们使用多维流式细胞术分析全面描绘了ICB敏感和耐药黑色素瘤小鼠模型中tdLN和原发肿瘤在淋巴管PD-L1敲除后的免疫学变化。尽管淋巴管PD-L1的缺失不影响肿瘤生长或进展，但我们观察到仅在ICB敏感肿瘤的TME中出现T细胞浸润的变化，包括增殖性PD-1+CD8+T细胞扩增和PD-1hiTh1细胞减少，提示抗肿瘤T细胞应答得到改善。因此，本研究提供了淋巴管PD-L1如何影响抗肿瘤免疫以及其如何可能影响黑色素瘤ICB治疗预后的新见解。

材料与方法

小鼠

本研究中的所有动物实验均获得负责的地方主管部门批准（卡尔斯鲁厄行政区，许可证G-177/22）。PD-L1LECKO小鼠由PD-L1flox小鼠（20）回交至C57BL/6N背景后与Prox1-CreERT2小鼠（21）杂交生成，此前已有描述（19）。为与肿瘤细胞系的性别匹配，使用雄性小鼠。Cre介导的重组通过腹腔注射他莫昔芬（50 mg/kg，溶于葵花籽油）连续五天处理7周龄小鼠来启动。Cre阴性同窝小鼠作为对照，同样接受他莫昔芬注射。小鼠可自由获取食物和饮用水。

肿瘤模型

最后一次注射后第三天，在小鼠双侧腋窝下皮下注射肿瘤细胞（异氟烷麻醉下）。接种的细胞数量如下：YUMM1.7和YUMM5.2细胞各2×10^5个，YUMMER1.7细胞2×10^6个，注射体积为25μL PBS。每周监测三次，通过游标卡尺测量评估肿瘤生长。当肿瘤体积达到1 cm3时，经颈椎脱位处死小鼠。通过腹腔注射FTY720（1 mg/kg，Sigma-Aldrich，目录号#SML0700）或载体对照（无菌水）抑制T细胞从tdLN输出。FTY720治疗在肿瘤细胞接种后第7天开始，共注射三次。在接种后第10天处死小鼠并采集组织进行分析。

细胞系

YUMMER1.7细胞（RRID: CVCL_A2AX；参考文献22）由康妮莉娅·哈林教授（瑞士苏黎世联邦理工学院，苏黎世，瑞士）于2023年惠赠，YUMM1.7和YUMM5.2细胞系（RRID: CVCL_JK16和CVCL_JK43；参考文献23）由乔纳森·斯利曼教授（海德堡大学曼海姆医学院，曼海姆，德国）于2024年惠赠。所有细胞系均在补充1%非必需氨基酸和10% FBS的DMEM/F12培养基中培养。每组实验开始前一周从新冻存管中解冻细胞，扩增不超过五代。细胞系常规使用支原体PCR检测试剂盒（Abcam，目录号#AB289834-1002）检测支原体污染，本研究中使用的所有细胞检测结果均为阴性。由于参考短串联重复序列图谱部分不可用，细胞系未进行认证。

组织处理

收集小鼠双侧的肿瘤引流腹股沟和腋窝淋巴结以及原发肿瘤。一个腹股沟淋巴结冷冻保存用于免疫荧光分析，其余淋巴结制备用于流式细胞术分析。淋巴结处理时，先用针头破坏被膜，然后在含有1 mg/mL IV型胶原酶（Thermo Fisher Scientific）和40 μg/mL DNase I（Roche）的DMEM溶液中酶解（补充2% FBS和1.2 mmol/L CaCl2），37°C消化20分钟。第一次消化后收集上清，残余淋巴结碎片在含有3.5 mg/mL IV型胶原酶和40 μg/mL DNase I的DMEM溶液中（补充2% FBS和1.2 mmol/L CaCl2）进行第二次消化，37°C消化15分钟。所得细胞悬液通过细胞筛过滤并在FACS缓冲液（PBS中含1% FBS、1 mmol/L EDTA和0.02% NaN3）中重悬，加入抗CD16/CD32（BioLegend，目录号#101302，RRID: AB_312801）后冰上放置。对于肿瘤处理，将肿瘤组织切碎后在含有3.5 mg/mL IV型胶原酶和40 μg/mL DNase I的DMEM溶液中（补充2% FBS和1.2 mmol/L CaCl2）37°C酶解30分钟。消化的肿瘤通过40μm细胞筛过滤，细胞悬液加入红细胞裂解缓冲液（0.15 mol/L NH4Cl、0.01 mol/L KHCO3和0.1 mmol/L Na2EDTA）处理。最后，将细胞在含有抗CD16/CD32的FACS缓冲液中重悬并冰上放置。

流式细胞术

细胞悬液在50μL Brilliant染色缓冲液（BD Biosciences）中用表面抗体（见补充表S1）在冰上染色一小时。表面染色后，使用Foxp3转录因子染色缓冲液套件（Thermo Fisher Scientific）固定和透化过夜，进行胞内染色（见补充表S1）。数据获取使用NothernLight仪器（Cytek，RRID: SCR_027072）完成，数据分析使用FlowJo（v10.10.0，BD Biosciences，RRID: SCR_008520）。高参数流式细胞术数据分析，包括投影和聚类，按照Ingelfinger等人的描述进行（24）。未混合的流式细胞术数据在FlowJo中进行补偿，免疫细胞群（CD3+CD8+、CD3+CD4+、CD3?CD19+以及CD11b+和/或CD11c+）通过手动设门。在可能的情况下，每个样本导出10,000个细胞。如果可用细胞数不足，则包含所有细胞。导出的细胞群在RStudio（v4.4.2，RRID: SCR_000432）中进行分析。使用CyCombine包合并来自不同小鼠模型实验的数据。降维前，数据经arcsinh转换并归一化至0到1的范围。应用统一流形近似和投影（UMAP）进行可视化，使用FlowSOM算法（RRID: SCR_016899）进行无监督聚类。聚类数量根据UMAP中的标志物投影确定，以确保相关性聚类。数据可视化使用ggplot2包（RRID: SCR_014601）完成，统计检验使用Student t检验。

tdLN（小鼠）免疫荧光染色与分析

淋巴结用4%多聚甲醛固定2小时，PBS洗一次，30%蔗糖中孵育过夜，然后用最佳切片温度化合物（Tissue-Tek）包埋并在?80°C冷冻保存。7μm厚的组织切片经PBS复水后用丙酮和80%甲醇固定。染色时，切片在含有5%驴血清、1% BSA、0.05% NaN3和0.1% Triton X-100的PBS封闭液中孵育1小时。随后加入相同封闭液中的初级抗体孵育一小时。使用的初级抗体为兔抗BRAFV600E（Thermo Fisher Scientific，目录号#MA5-24661，RRID: AB_2661889）和抗CD45-生物素（BioLegend，目录号#103104，RRID: AB_312969）。洗涤后，切片在PBS中用次级抗体孵育一小时：驴抗兔AF594（Thermo Fisher Scientific，目录号#A-21207，RRID: AB_141637）、链霉亲和素-AF488（BioLegend，目录号#405235）和Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，目录号#H3569，RRID: AB_2651133）。切片洗涤后封片，使用Axioscan 7（Zeiss）扫描仪成像。为定量YUMM5.2、YUMM1.7和YUMMER1.7引流淋巴结中BRAFV600E+转移区域，对多个间距约100μm的淋巴结切片进行CD45和BRAFV600E染色。以天真淋巴结作为对照。使用合并的免疫荧光通道识别CD45?/BRAFV600E+细胞簇。从手动勾勒的转移区域进行颗粒分析，并将结果归一化至覆盖整个淋巴结截面的预定义感兴趣区域（ROI）的尺寸。

人黑色素瘤引流淋巴结福尔马林固定石蜡包埋组织的多重成像

本研究中人类样本的使用获得慕尼黑工业大学（TUM）伦理委员会批准（批准号：2022-140-1-S-KH），以及德国海德堡大学伦理委员会II的批准（2010-318N-MA和2014-835R-MA）。根据《赫尔辛基宣言》，从每位捐赠组织的个人处获得书面知情同意。来自TUM病理学系三名患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）局部区域转移性黑色素瘤引流淋巴结切片经脱蜡和复水后，分别用EDTA或柠檬酸缓冲液进行抗原修复。使用PhenoCycler仪器（Akoya Biosciences，RRID: SCR_023773）进行多重荧光染色，使用兔抗PROX1（Abcam，目录号#ab199359，RRID: AB_2868427）、小鼠抗podoplanin（Agilent，目录号#M3619，RRID: AB_2162081）、兔抗PRAME（Cell Signaling Technology，目录号#56426，RRID: AB_2799510）、兔抗NT5E（Cell Signaling Technology，目录号#13160，RRID: AB_2716625）和兔抗PD-L1（Cell Signaling Technology，目录号#13684，RRID: AB_2687655），随后使用相应的OPAL检测试剂。图像使用QuPath（RRID: SCR_018257）进行分析。选择包括整个淋巴结区域（排除转移区域）和SCS区域的感兴趣区域（ROI）。

随后，通过检测使用针对该淋巴结切片特定定义的荧光强度阈值所识别到的PROX1+细胞核来确定LECs。接着，围绕每个检测到的细胞核向外扩展2 μm的边界以包含周围的胞质区域。细胞核检测参数设置为最小面积1 μm2、最大面积1,000 μm2，sigma值为2 μm。对于每个PROX1+事件，导出所有相关通道的平均荧光强度。在R软件中，根据CD73和podooplanin（D2-40）的强度将导出的值分类为LEC亚群，其中每种标志物的阈值均针对每个淋巴结切片分别定义。PD-L1平均表达值归一化至双阴性（CD73? podoplanin?）亚群后，使用GraphPad Prism在各亚群间进行分析。为定量分析淋巴结转移引流域中淋巴结转移者（R）和无应答者（NR）患者淋巴管中的PD-L1，我们对10名患者的黑色素瘤引流淋巴结福尔马林固定石蜡包埋切片进行了染色[n = 6（NR）对比 n = 4（R）]，这些患者接受了辅助性治疗中的nivolumab（抗PD-1）以及部分同时接受ipilimumab（抗CTLA4）治疗（补充表S2）。切片在60°C烘烤30分钟后，依次经二甲苯和乙醇浴进行脱蜡处理。随后将切片置于Tris-EDTA（pH 9）表位修复缓冲液中于97°C孵育10分钟，在缓冲液中冷却20分钟后进行封闭步骤。然后对claudin-5（Thermo Fisher Scientific，货号#35-2500，RRID：AB_2533200）和PD-L1（Cell Signaling Technology，货号#13684，RRID：AB_2687655）进行染色，随后使用相应的次抗体[驴抗鼠AF594（Thermo Fisher Scientific，货号#A-11005，RRID：AB_2534073），驴抗兔AF647（Thermo Fisher Scientific，货号#A-31573，RRID：AB_2536183）]以及Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，货号#H3569，RRID：AB_2651133）。最后，切片封片并使用STELLARIS 8共聚焦显微镜（Leica Microsystems，RRID：SCR_024664）进行扫描。图像使用Fiji（RRID：SCR_002285；参考文献25）进行分析。为定量淋巴管上的PD-L1，分别绘制了包围整个淋巴结区域的感兴趣区域（ROI）和位于SCS区域下方的ROI。定量前清除图像中的外部区域、受损区域和染色伪影。随后将图像分割为单独的荧光通道。在调整并施加claudin-5通道的适当阈值后，创建二值图像并使用腐蚀和膨胀函数进行处理，生成合并血管结构的掩膜。最后，选择面积>50 μm2的结构并将其投影至PD-L1通道，以测量其平均PD-L1染色强度。SCS区域和髓质/皮质区域采用此方法分别进行分析。具有明显低至缺失PD-L1染色强度的区域被用作背景信号。

癌症基因组图谱（TCGA）数据分析

使用UCSC Xena浏览器（RRID：SCR_018938；参考文献26）研究了淋巴结CD274表达与皮肤黑色素瘤（SKCM）队列患者总生存期之间的相关性。采用表达中位值作为截断值将患者分为低表达和高表达组。统计检验采用log-rank检验。

统计学分析

统计检验使用GraphPad Prism（v10.2.3，RRID：SCR_002798）和RStudio（v4.4.2，RRID：SCR_000432）进行。图中以星号标注统计学显著性；未显示显著性标注时，该比较不具有统计学显著性。每项实验所采用的统计检验方法及结果详见图注。P值小于0.05视为具有统计学显著性。FTY720研究中排除了一只Cre+小鼠，该小鼠在肿瘤T细胞浸润方面被识别为离群值（采用ROUT方法，Q = 1%）。

**结果**

**人黑色素瘤引流淋巴结中fLECs和mLECs表达PD-L1**

在小鼠淋巴结中，已证实fLECs和mLECs在稳态及病理条件下于mRNA和蛋白水平均有组成性PD-L1表达。与此一致，对癌症患者无转移淋巴结进行单细胞RNA测序的结果已证实mLEC和fLECs中存在PD-L1转录本（27, 28）。然而，迄今为止尚未证明人类淋巴结中淋巴PD-L1在蛋白水平的表达。因此，我们建立了一套多重免疫荧光染色方案，用于检测黑色素瘤患者tdLNs中的淋巴PD-L1表达（图1A）。我们纳入了PROX1作为泛LEC标记物、CD73（NT5E）作为cLEC标记物以及podoplanin（D2-40）——后者广泛表达于外周LECs（27）。此外，我们还对PRAME（一种黑色素瘤标记物）进行染色以检测转移灶。在来自一小群黑色素瘤患者（N = 3，补充表S2；图1A）的淋巴结中，PROX1+细胞核清晰可辨。我们发现许多LECs既不表达CD73也不表达podoplanin，而部分LECs呈单阳性或双阳性。值得注意的是，CD73在SCS区域可靠地染色了cLECs，但在整个淋巴结中并非可靠的cLEC标记物。在单个淋巴窦内即可观察到异质性表达——某些LECs表达podoplanin而其他LECs呈CD73+，即使在淋巴结皮质深层也是如此（图1A）。与CD73和podoplanin的表达模式相呼应，PD-L1表达在LECs间也表现出显著异质性，显示个别PD-L1+和PD-L1? LECs有时甚至出现在同一淋巴窦横截面中（白色箭头所示，图1A）。

**图1.** 人黑色素瘤引流淋巴结中淋巴结LEC的PD-L1表达。**A**，人黑色素瘤引流淋巴结中CD73（红色）、PROX1（绿色）、PD-L1（粉色）、podoplanin（D2-40，浅蓝色）、PRAME（黄色）及细胞核（蓝色）的免疫荧光染色代表性显微图像。放大视图展示了SCS和皮质区域的代表性视野。**B**，经CD73和podoplanin定义的PROX1+ LECs亚群（>2,000个/患者）在淋巴结总面积和SCS区域的PD-L1平均荧光强度定量，强度已归一化至双阴性（DN）亚群。N = 3名患者。**，P < 0.01；单因素ANOVA配合?ídák事后检验。PODO，podoplanin。**C**，人黑色素瘤数据（SKCM-TCGA数据集，筛选淋巴结为手术/活检部位）中CD274基因表达与总生存期相关的Kaplan-Meier曲线。以基因表达中位值作为截断值。采用log-rank检验进行统计分析。**D**，黑色素瘤患者tdLN中claudin-5和PD-L1的免疫荧光代表性图像。**E**，代表性NR和R患者黑色素瘤引流淋巴结SCS区域的放大视图。**F**，经claudin-5+血管结构在SCS区域和淋巴结内部区域的PD-L1平均荧光强度定量，已归一化至低PD-L1水平背景。N = 4-6名患者/组。Student t检验。

在定量分析中，根据PROX1染色在淋巴结完整横截面或仅SCS区域中选取单个LEC细胞核（补充图S1A和S1B），并将围绕这些细胞核的扩展区域作为LEC细胞体的替代。随后，我们根据CD73和podoplanin的表达将LECs分为四个表型亚群，并确定各亚群中PD-L1的平均荧光强度。当考虑整个淋巴结区域时，在四个LEC亚群之间未能检测到归一化PD-L1染色强度的显著差异，尽管三个淋巴结中有两个显示CD73+ podoplanin? LECs的PD-L1表达较低（图1B；补充图S1A）。相比之下，在SCS区域中，PD-L1表达在CD73和podoplanin双阴性的fLECs中被持续观察到，而CD73+ podoplanin? cLECs表现出相对较低的PD-L1表达。对所有三例患者进行强度定量分析确认，SCS cLECs（CD73+ podoplanin?）的PD-L1染色强度比CD73?亚群低约三倍（图1B；补充图S1B）。综上所述，这些数据表明PD-L1在人类黑色素瘤引流淋巴结的LECs中以蛋白水平表达，其中CD73+ SCS cLECs表现出低至无PD-L1表达，与fLECs及淋巴结皮质中的其他LECs形成对比，反映了小鼠淋巴结LEC中PD-L1的表达模式。

PD-L1/PD-1通路是黑色素瘤ICB治疗的既定靶点，但仅部分患者对ICB表现出持久应答。为探究淋巴PD-L1表达与ICB疗效之间的潜在关系，我们首先从The Cancer Genome Atlas数据库中提取了淋巴结PD-L1（由CD274基因编码）表达与皮肤黑色素瘤患者生存率之间的数据，发现高PD-L1表达与良好预后之间存在强相关性（图1C）。由于bulk RNA测序无法区分包括LECs在内的特定细胞类型中的PD-L1表达，我们随后对一小群在我们中心接受辅助性nivolumab（抗PD-1）治疗并产生应答或无应答的黑色素瘤患者的tdLN切片进行了染色（补充表S2）。PD-L1在由泛内皮标记物claudin-5所识别的血管结构中进行定量（图1D；补充图S1C；参考文献29）。有趣的是，在分析SCS区域时，其中claudin-5+血管结构主要对应淋巴窦，ICB-R患者相比NR（无应答者），这些claudin-5+血管中的PD-L1染色强度倾向于高出约20%（无统计学显著性，图1E和F）。在分析淋巴结皮质和内部区域时，观察到ICB-Rs PD-L1表达增加的非显著趋势（图1F）。若这些结果在更大患者队列中得到验证，则可能提示淋巴PD-L1表达与黑色素瘤患者的ICB应答性相关。然而，我们对淋巴结内部和皮质区域的分析可能同时包含血管内皮，且我们的患者队列规模较小，无法确定统计学显著性。

**淋巴PD-L1敲除不影响小鼠黑色素瘤的生长或进展**

在确认淋巴结LECs在黑色素瘤患者中表达PD-L1之后，我们随后利用临床相关的黑色素瘤小鼠模型检验了LEC表达的PD-L1在肿瘤免疫中的作用。为此，我们选择了三种携带人类黑色素瘤常见突变的同基因黑色素瘤模型：YUMM5.2（BrafV600E/wt，P53?/?）、YUMM1.7（BrafV600E/wt，Pten?/?，Cdkn2a?/?）以及YUMMER1.7（22, 23）——后者是一种紫外线诱导体细胞高突变的YUMM1.7衍生株，因其突变负荷增加而被描述为对ICB敏感，而YUMM1.7和YUMM5.2则对ICB具有耐药性（22, 30）。因此，该系列黑色素瘤模型使我们能够评估淋巴PD-L1在不同ICB应答性条件下的影响，模拟了黑色素瘤ICB治疗结局方面的临床异质性。将肿瘤细胞皮内注射至经他莫昔芬处理的PD-L1fl/fl × Prox1-CreERT2小鼠（PD-L1LECKO小鼠）两侧侧腹，监测肿瘤生长直至第一只小鼠达到1 cm3肿瘤体积（图2A）。流式细胞术在研究终点时确认了淋巴结LECs上PD-L1的有效敲除，且未影响其频率（图2B；补充图S2A和S2B）。值得注意的是，与我们此前使用B16-F10黑色素瘤模型的结果类似（19），在测试的任何黑色素瘤模型中，淋巴结LEC表达的PD-L1敲除均未影响原发肿瘤的生长（图2C）。

接下来，我们利用针对YUMM细胞系BRAFV600E突变的抗体，结合CD45，调查了各黑色素瘤模型中相应引流淋巴结（tdLNs）内转移的发生情况（图2D和E）。在各类模型中，YUMM5.2表现出最高的转移负荷，而YUMM1.7和YUMMER1.7细胞系显示出相似但较低的水平。内皮细胞（LEC）表达的PD-L1的缺失并未改变任何模型中tdLN转移的发生情况（图2E）。图2。淋巴PD-L1不影响黑色素瘤肿瘤生长或tdLN中的转移。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠连续5天接受他莫昔芬处理，然后经皮内（ID）接种同系黑色素瘤细胞（箭头所示）。当肿瘤体积达到1 cm3时，处死小鼠。B，用他莫昔芬处理的PD-L1LECKO小鼠中YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2引流淋巴结内LEC（CD45? podoplanin+ CD31+）和PD-L1+ LEC的频率。****，P < 0.0001；双因素方差分析（two-way ANOVA）及?ídák事后检验。C，用他莫昔芬处理的PD-L1LECKO小鼠中YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2的肿瘤生长曲线。肿瘤生长通过卡尺测量监测。N = 4–7只/组。D，免疫荧光染色的代表性显微图像，针对所指示黑色素瘤模型引流淋巴结中的BRAFV600E（红色）、CD45（绿色）和细胞核（蓝色）。仅显示Cre-组。箭头指示转移结节。E，初始（na?ve）和黑色素瘤引流淋巴结中转 移面积的定量分析。N = 4–7个淋巴结/组。虚线代表使用初始淋巴结获得的背景染色。Student t检验。图2。淋巴PD-L1不影响黑色素瘤肿瘤生长或tdLN中的转移。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠连续5天接受他莫昔芬处理，然后经皮内（ID）接种同系黑色素瘤细胞（箭头所示）。当肿瘤体积达到1 cm3时，处死小鼠。B，用他莫昔芬处理的PD-L1LECKO小鼠中YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2引流淋巴结内LEC（CD45? podoplanin+ CD31+）和PD-L1+ LEC的频率。****，P < 0.0001；双因素方差分析及?ídák事后检验。C，用他莫昔芬处理的PD-L1LECKO小鼠中YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2的肿瘤生长曲线。肿瘤生长通过卡尺测量监测。N = 4–7只/组。D，免疫荧光染色的代表性显微图像，针对所指示黑色素瘤模型引流淋巴结中的BRAFV600E（红色）、CD45（绿色）和细胞核（蓝色）。仅显示Cre-组。箭头指示转移结节。E，初始和黑色素瘤引流淋巴结中转移面积的定量分析。N = 4–7个淋巴结/组。虚线代表使用初始淋巴结获得的背景染色。Student t检验。关闭图2。淋巴PD-L1缺失增加ICB敏感型黑色素瘤中增殖性PD-1+ T细胞的含量。

为了表征靶向淋巴PD-L1缺失后tdLNs和原发肿瘤中的免疫景观，我们在研究终点收集这些组织并进行了深入的流式细胞术分析。首先，我们手动设门筛选了tdLNs和原发肿瘤中的CD8+和CD4+ T细胞群（补充图S3A）。尽管与其他模型相比，YUMMER1.7肿瘤显示出最多的肿瘤浸润性CD8+ T细胞，但在淋巴PD-L1缺失后，tdLNs和肿瘤微环境（TME）中CD8+和CD4+ T细胞计数均未观察到显著变化（图3A；补充图S3B）。同样，Foxp3+调节性T细胞（Treg）和辅助性T细胞（Th）的相对频率也未观察到显著差异（补充图S3C）。为了深入分析淋巴PD-L1缺失后tdLNs和原发肿瘤中的T细胞组成，我们应用了高维流式细胞术，包括T细胞亚群、激活和耗竭状态的标志物，然后进行无监督聚类。在tdLNs中，我们鉴定出11个CD8+ T细胞群（图3B和C）。在所有黑色素瘤模型中，CD8+ T细胞的优势群包括一个CD44+ TCF1+干性样T细胞群（簇2）和两个初始CD8+ T细胞群（簇3和4；图3C和D）。值得注意的是，与YUMM1.7和YUMM5.2引流淋巴结不同，YUMMER1.7引流淋巴结中的增殖性CD62L+ PD-1int T细胞（簇1）比例高出四到五倍，并且在淋巴PD-L1缺失后趋于进一步增加（图3D和E）。在TME中，我们鉴定出12个浸润性CD8+ T细胞群（图3F和G）。在原发YUMMER1.7肿瘤中，相应增殖性CD62L+ PD-1int T细胞群（簇1）的频率再次高于其他模型（约2-3倍），并且在淋巴PD-L1缺失后显著进一步增加（图3H和I）。此外，一个PD-1hi TOXhi耗竭性T细胞群（簇10）在YUMMER1.7肿瘤TME中与其他模型相比显著增加，但未受到淋巴PD-L1缺失的显著影响（图3H）。综合来看，这些发现表明，在YUMMER1.7模型中淋巴PD-L1缺失可能促进tdLNs中增殖性CD8+ T细胞的增殖和/或向外迁移，从而促进它们迁移至TME中并分化为耗竭性T细胞。或者，表达PD-L1的肿瘤相关LEC可能在TME内直接抑制T细胞增殖。然而，淋巴PD-L1缺失后该T细胞亚群在TME中增加的积累量不足以减少YUMMER1.7模型中原发肿瘤的生长。相反，ICB耐药型黑色素瘤中的T细胞几乎不受淋巴PD-L1缺失的影响。图3。淋巴PD-L1缺失特异性地增加仅在ICB敏感型黑色素瘤中增殖性PD-1+ CD8+ T细胞的含量。A，tdLNs中每淋巴结及原发肿瘤组织中每毫克的CD8+和CD4+ T细胞平均（Avg.）计数，针对YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2黑色素瘤模型。N = 4–7只/组。双因素方差分析及?ídák事后检验。B，tdLNs中CD8+ T细胞的UMAP及无监督聚类，以及每个模型和条件的单独UMAP图。C，热图展示所有簇的平均标志物表达。D，在指定处理条件下tdLNs中CD8+ T细胞各簇频率的热图。E，通过经典流式细胞术设门确定在指定条件下tdLNs中Ki67+ CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞（簇1）的频率。N = 4–7只/组。双因素方差分析及?ídák事后检验。F，TME中CD8+ T细胞的UMAP及无监督聚类，以及每个模型和条件的单独UMAP。G，热图展示所有簇的平均标志物表达。H，在指定处理条件下TME中CD8+ T细胞各簇频率的热图。*，P < 0.05；Student t检验。I，通过经典流式细胞术设门确定在指定条件下TME中Ly6C– Ki67+ CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞（簇1）的频率。N = 4–7只/组。*，P < 0.05；双因素方差分析及?ídák事后检验。APO，apotracker；Tex，耗竭性T细胞；Tpex，前体耗竭性T细胞。图3。淋巴PD-L1缺失特异性地增加仅在ICB敏感型黑色素瘤中增殖性PD-1+ CD8+ T细胞的含量。A，tdLNs中每淋巴结及原发肿瘤组织中每毫克的CD8+和CD4+ T细胞平均计数，针对YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2黑色素瘤模型。N = 4–7只/组。双因素方差分析及?ídák事后检验。B，tdLNs中CD8+ T细胞的UMAP及无监督聚类，以及每个模型和条件的单独UMAP图。C，热图展示所有簇的平均标志物表达。D，在指定处理条件下tdLNs中CD8+ T细胞各簇频率的热图。E，通过经典流式细胞术设门确定在指定条件下tdLNs中Ki67+ CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞（簇1）的频率。N = 4–7只/组。双因素方差分析及?ídák事后检验。F，TME中CD8+ T细胞的UMAP及无监督聚类，以及每个模型和条件的单独UMAP。G，热图展示所有簇的平均标志物表达。H，在指定处理条件下TME中CD8+ T细胞各簇频率的热图。*，P < 0.05；Student t检验。I，通过经典流式细胞术设门确定在指定条件下TME中Ly6C– Ki67+ CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞（簇1）的频率。N = 4–7只/组。*，P < 0.05；双因素方差分析及?ídák事后检验。APO，apotracker；Tex，耗竭性T细胞；Tpex，前体耗竭性T细胞。关闭图3。淋巴PD-L1缺失减少ICB敏感型黑色素瘤TME中PD-1hi Th1细胞的含量。

LEC已被证明可表达MHC-I分子，并影响自身反应性和肿瘤特异性CD8+ T细胞（9, 19）。此外，LEC也表达MHC-II分子，但尚不清楚它们自身能否加载外源性肽段，或从其他细胞获得肽-MHC-II复合物（12, 31, 32）。尽管如此，先前的研究表明LEC表达的MHC-II会导致CD4+ T细胞功能障碍，通过阻碍其增殖和存活，以及激活Treg（12, 32）。因此，我们调查了淋巴PD-L1缺失是否影响tdLNs和原发肿瘤中的CD4+ T细胞亚群。在tdLNs中，对CD4+ T细胞的无监督聚类产生了10个不同的簇，包括一个优势初始CD4+ T细胞簇（簇1），该簇未向任何已定义的CD4+ Th亚群极化（图4A–C）。无论是该簇还是其他任何簇，包括Treg、增殖性CD4+ T细胞和Th17细胞，均未受到淋巴PD-L1缺失的影响（图4A–C）。相反，在TME中，对浸润性CD4+ T细胞的无监督聚类产生了10个簇，其中Foxp3+ Treg（簇3、5、6、8、9和10）和一个PD-1hi Th1 T细胞簇（簇7）代表了优势的CD4+ T细胞群体（图4D–F）。有趣的是，在YUMMER1.7肿瘤中，淋巴PD-L1缺失特异性地导致这个PD-1hi Th1 T细胞簇（簇7）减少约20%（图4E–G）。这一发现表明淋巴PD-L1在维持TME中PD-1hi Th1细胞方面可能具有潜在作用。图4。淋巴PD-L1缺失特异性地减少YUMMER1.7原发肿瘤中PD-1+ Th1细胞的含量。A，tdLNs中CD4+ T细胞的UMAP及无监督聚类，以及每个黑色素瘤模型和条件的单独UMAP。B，热图展示所有簇的平均标志物表达。C，在指定处理条件下tdLNs中CD4+ T细胞各簇频率的热图。D，TME中CD4+ T细胞的UMAP及无监督聚类，以及每个黑色素瘤模型和条件的单独UMAP。E，热图展示所有簇的平均标志物表达。F，在指定处理条件下TME中CD4+ T细胞各簇频率的热图。*，P < 0.05；Student t检验。G，通过经典流式细胞术设门确定在指定条件下TME中PD-1+ CD44+ Foxp3? CD4+ T细胞（簇7）的频率。N = 4–7只/组。*，P < 0.05；Student t检验。APO，apotracker。图4。淋巴PD-L1缺失特异性地减少YUMMER1.7原发肿瘤中PD-1+ Th1细胞的含量。A，tdLNs中CD4+ T细胞的UMAP及无监督聚类，以及每个黑色素瘤模型和条件的单独UMAP。B，热图展示所有簇的平均标志物表达。C，在指定处理条件下tdLNs中CD4+ T细胞各簇频率的热图。D，TME中CD4+ T细胞的UMAP及无监督聚类，以及每个黑色素瘤模型和条件的单独UMAP。E，热图展示所有簇的平均标志物表达。F，在指定处理条件下TME中CD4+ T细胞各簇频率的热图。*，P < 0.05；Student t检验。G，通过经典流式细胞术设门确定在指定条件下TME中PD-1+ CD44+ Foxp3? CD4+ T细胞（簇7）的频率。N = 4–7只/组。*，P < 0.05；Student t检验。APO，apotracker。关闭图4。淋巴PD-L1缺失不影响tdLNs和TME中的髓系和B细胞群体。

除T细胞外，淋巴结和TME中还含有大量B细胞和多种髓系细胞亚群。尽管某些免疫细胞驻留在淋巴结内，但许多免疫细胞从外周组织迁移至引流淋巴结（dLNs），在其中发挥启动和调节适应性免疫反应的关键作用。近期证据表明PD-1在B细胞和髓系细胞群体中均有表达（33–35）。

这表明，淋巴管内皮细胞（LECs）表达的PD-L1原则上可以调节T细胞之外的多种免疫细胞类型的活性。因此，我们分析了ICB敏感和耐药黑色素瘤模型中引流淋巴结（tdLNs）和原发肿瘤的B细胞和髓系细胞群体，以确定淋巴管PD-L1缺失是否影响其组成或表型。淋巴管PD-L1缺失后，tdLNs和原发肿瘤中髓系细胞的频率和数量未受影响（补充图S4A和S4B）。类似地，尽管对tdLNs和原发肿瘤中CD11b+和CD11c+（CD11b+/CD11c+）双阳性或单阳性髓系细胞进行深度流式细胞术分析并使用无监督聚类表明YUMMER1.7肿瘤微环境（TME）被粒细胞（簇4）大量浸润，但淋巴管PD-L1耗竭后未见差异（补充图S4C–S4H）。与自然杀伤髓系细胞类似，tdLNs和TME中B细胞总体群未受淋巴管PD-L1耗竭的影响（补充图S5A和S5B）。对tdLNs中CD19+B细胞景观的无监督聚类定义了10个簇，其中一个主要B细胞簇表达高水平的活化标志物（CD80、CD86）和MHC-II（补充图S5C和S5D）。然而，淋巴管PD-L1缺失后，没有任何B细胞簇发生改变（补充图S5E）。在TME内，B细胞的频率过低，无法进行深入分析（补充图S5B）。综上所述，这些结果表明淋巴管PD-L1不影响tdLNs和原发肿瘤中髓系细胞或B细胞群体的组成或表型分布。

tdLNs中淋巴管PD-L1对增殖性PD-1+ T细胞的局部调节

为了解决淋巴管PD-L1是否通过干扰tdLNs内的迁移或扩增来影响CD8+ T细胞向TME的募集，还是肿瘤相关淋巴管中的PD-L1在TME内局部抑制了CD8+ T细胞，我们使用FTY720阻断了携带YUMMER1.7肿瘤的PD-L1LECKO小鼠的淋巴细胞从tdLNs流出（图5A）。肿瘤生长不受治疗影响（补充图S6A）。在终点时，我们收集tdLNs和肿瘤以评估流出阻断对这些器官内T细胞群体的影响。

图5. 查看大图 下载幻灯片
淋巴管PD-L1调节YUMMER1.7引流淋巴结内增殖性CD44+ CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠用他莫昔芬连续治疗5天，然后皮下接种YUMMER1.7黑色素瘤细胞（由箭头指示）。在第7、8和9天，小鼠腹腔注射FTY720，然后在第10天处死。B和C，在指示治疗下，YUMMER1.7黑色素瘤模型tdLNs（B）和原发肿瘤（C）中每淋巴结或每毫克肿瘤的CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞以及Ki67+ CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞计数。N = 3–5只小鼠/组。*，P < 0.05；**，P < 0.01；单向方差分析（one-way ANOVA）加?ídák事后检验。D，提出的作用模式示意图。在Cre-小鼠中（上方），tdLNs中LECs表达的PD-L1抑制早期活化CD8+ T细胞的活化、增殖或淋巴结流出，限制其在TME中的迁移和积聚。在缺乏淋巴管PD-L1表达的Cre+小鼠中，tdLNs输出早期活化CD8+ T细胞增强，导致TME浸润增加。BV，血管；LV，淋巴管。

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淋巴管PD-L1调节YUMMER1.7引流淋巴结内增殖性CD44+ CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠用他莫昔芬连续治疗5天，然后皮下接种YUMMER1.7黑色素瘤细胞（由箭头指示）。在第7、8和9天，小鼠腹腔注射FTY720，然后在第10天处死。B和C，在指示治疗下，YUMMER1.7黑色素瘤模型tdLNs（B）和原发肿瘤（C）中每淋巴结或每毫克肿瘤的CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞以及Ki67+ CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞计数。N = 3–5只小鼠/组。*，P < 0.05；**，P < 0.01；单向方差分析（one-way ANOVA）加?ídák事后检验。D，提出的作用模式示意图。在Cre-小鼠中（上方），tdLNs中LECs表达的PD-L1抑制早期活化CD8+ T细胞的活化、增殖或淋巴结流出，限制其在TME中的迁移和积聚。在缺乏淋巴管PD-L1表达的Cre+小鼠中，tdLNs输出早期活化CD8+ T细胞增强，导致TME浸润增加。BV，血管；LV，淋巴管。

关闭图5

如预期，FTY720治疗增加了tdLNs中CD3+ T细胞的数量，与有效阻断淋巴细胞流出一致（图5B）。这一增加是由CD4+和CD8+ T细胞的积聚驱动的，因为FTY720治疗后两个亚群的数量均升高（图5B）。相反，FTY720治疗后tdLNs中T细胞的相对频率仅轻微增加（补充图S6B）。有趣的是，缺乏淋巴管PD-L1小鼠的FTY720治疗导致tdLNs中CD3+、CD4+和CD8+ T细胞较Cre阴性对照积累更多，最高达两倍（图5B）。并行地，缺乏淋巴管PD-L1小鼠的FTY720治疗减少了TME中CD3+、CD4+和CD8+ T细胞的数量（图5C）。接下来，我们检查了FTY720治疗对这些器官中增殖性CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞亚群的影响。在阻断淋巴结流出后，我们观察到YUMMER1.7引流淋巴结中这一特定T细胞亚群显著积累2–3倍，无论是否缺失淋巴管PD-L1，证实这些细胞在淋巴结内增殖和/或积聚并被阻止流出（图5B；补充图S6B）。相反，在TME内，FTY720治疗后增殖性CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞的数量减少，无论是否缺失淋巴管PD-L1（图5C；补充图S6C）。因此，淋巴管PD-L1缺失后这一特定T细胞亚群在TME内的扩增取决于来自淋巴结的持续T细胞输入。

综上所述，我们的发现符合这样一个模型：淋巴管PD-L1主要调节tdLNs内肿瘤特异性T细胞活化的早期步骤，并对它们在TME中的积聚产生下游影响（图5D）。

讨论

在本研究中，我们证实PD-L1蛋白由人类黑色素瘤引流淋巴结中的LECs表达。我们发现fLECs表达一致的PD-L1，而淋巴结皮质中的LECs表达更具异质性，SCS cLECs显示最少的PD-L1染色，与小鼠淋巴结中的表达模式一致。然而，我们的量化方法存在局限性，因为我们无法使用染色面板中包含的标志物准确识别所有LEC亚群的全部细胞体。尽管PROX1染色允许非常特异性地识别LEC细胞核，但由于组织切片中LEC的伸长和不规则形态，我们可能只量化了属于每个LEC的PD-L1染色的一部分。此外，区分人类淋巴结LEC亚群的稳健标志物缺乏。CD73已被提议作为cLEC标志物（27），但我们在淋巴结皮质/髓质中发现大量LECs也是CD73+，使单个LECs的亚群分配复杂化。类似地，能有效标记皮肤和其他组织LEC的podoplanin在淋巴结中显示不连续、斑驳的染色。要准确量化人类淋巴结切片中主要LEC亚群的PD-L1表达，识别可靠、亚群特异性的LEC标志物进行共染色将是必要的。

有趣的是，淋巴结淋巴管PD-L1表达与一小队列黑色素瘤患者的辅助ICB反应性相关，这一发现可能促进进一步的努力，以确定淋巴管PD-L1表达在ICB治疗背景下是否具有潜在的预测价值。然而，需要评估更大的患者队列，以确定淋巴管PD-L1水平是否适合作为黑色素瘤患者ICB的预测生物标志物。

为了更好地理解淋巴管PD-L1的功能相关性，我们在小鼠中基因缺失淋巴管PD-L1后，深入而全面地表征了ICB敏感（YUMMER1.7）和耐药（YUMM1.7和YUMM5.2）黑色素瘤模型tdLNs和原发肿瘤的免疫景观。尽管淋巴管PD-L1缺失未减少原发黑色素瘤生长或转移，但我们观察到仅在ICB敏感的YUMMER1.7模型中对肿瘤T细胞浸润有显著影响，其特征是增殖性CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞积聚和PD-1hi Th1细胞减少。tdLNs中的早期CD8+ T细胞，特别是干细胞样和Tpex细胞，已被鉴定为ICB效力的介导者。在PD-L1/PD-1阻断下，这些细胞扩增并迁移至肿瘤，为TME内的耗竭T细胞池提供燃料（3，8，36，37）。我们的结果符合这样一个模型：在突变负荷高且有大量肿瘤相关抗原可供识别的"热"、ICB敏感黑色素瘤中，淋巴管PD-L1限制此类CD8+ T细胞向TME途中的淋巴结输出。相反，在ICB耐药黑色素瘤中，淋巴管PD-L1对肿瘤免疫不发挥显著的调节作用，可能是因为肿瘤相关抗原稀少且淋巴结LECs对其交叉呈递有限。

在tdLNs内，我们仅观察到淋巴管PD-L1缺失对CD8+ T细胞景观的边际影响，而我们此前已证明淋巴管PD-L1促进tdLNs中肿瘤抗原特异性CD44+ CD62L+ CD8+ T细胞的扩增（19）。由于YUMM黑色素瘤模型是无黑色的且免疫优势肿瘤抗原未知，我们在本研究中只能表征tdLNs中的全局CD8+区室，遗漏了淋巴管PD-L1对单个肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞克隆的潜在影响。此外，淋巴管PD-L1可能特别影响跨皮质淋巴管内皮迁移并通过输出淋巴管退出tdLNs的T细胞，这将导致TME中T细胞景观的重塑比tdLNs更为明显。根据这一假设，我们观察到使用FTY720阻断tdLNs淋巴细胞流出导致缺乏淋巴管PD-L1小鼠中T细胞积聚加剧，与对照相比。或许FTY720介导的S1P信号阻断可能导致T细胞保留在淋巴窦附近，延长其暴露于淋巴管PD-L1的时间，后者抵消其活化或增殖。然而，要证实这一假设，需要额外的实验来精确定位tdLNs内单个T细胞亚群的位置以及PD-L1/PD-1相互作用。

除了CD8+ T细胞外，我们的数据揭示了与ICB耐药模型相比，在ICB敏感的YUMMER1.7模型原发肿瘤中淋巴管PD-L1缺失后PD-1hi Th1亚群减少。尽管LECs获取抗原负载MHC-II分子的机制尚不完全清楚，但先前的研究表明LECs可通过MHC-II损害CD4+ T细胞增殖和存活（12，32）。潜在地，据报道YUMMER1.7 TME中因高CD8+ T细胞浸润而丰富的细胞因子IFNγ（38），可能在该模型中诱导LECs上调MHC-II，有利于LEC-CD4 T细胞相互作用（32）。然而，淋巴管PD-L1如何调节PD-1hi Th1细胞的具体机制以及这种相互作用对肿瘤免疫的潜在影响无法在本研究中解决。

PD-L1由淋巴结LECs组成性表达于相当高的水平。相比之下，外周LECs，如真皮LECs，通常缺乏PD-L1，但在IFNγ刺激下可上调其表达，如肿瘤相关淋巴管中所观察到的（17，18）。由于肿瘤相关淋巴管通常罕见，我们无法评估在小鼠模型中TME内LECs的PD-L1是否被有效缺失。无论如何，我们不能排除肿瘤相关LECs上的PD-L1缺失直接影响TME内T细胞的频率或活化状态，特别是那些通过淋巴系统循环回tdLNs的细胞。然而，FTY720治疗后获得的结果表明，TME中T细胞景观的改变更多地是由于tdLNs T细胞输出的差异。

总而言之，我们的数据显示淋巴管PD-L1是调节黑色素瘤引流淋巴结内早期T细胞活化的一个重要因素，并且可能对黑色素瘤患者的ICB反应性具有重要意义。

数据可用性

支持本研究结果的数据可在文章、补充文件或向通讯作者提出合理要求时获得。

**作者披露声明**

S.A. Wohlfeil报告：在本研究提交工作之外，曾从 Bristol Myers Squibb 和 Merck Sharp & Dohme 获得个人费用，从 Pierre Fabre 获得非资金支持，并从 Sun Pharma 获得个人费用和非资金支持。J. Utikal 在本研究提交工作之外，担任 Amgen、Bristol Myers Squibb、GlaxoSmithKline、Immunocore、Leo Pharma、Merck Sharp and Dohme、Novartis、Pierre Fabre、Rheacell、Roche、Sanofi 的顾问委员会委员，或曾接受上述机构的酬金及差旅支持。M. Tulessin 无可披露事项。其他作者均未报告披露事项。

**作者贡献**

E. Reynaud：概念构思、数据管理、形式分析、调查研究、可视化呈现、方法学设计、撰写——原始草稿撰写、撰写——审阅与编辑。
S. Belherazem：形式分析、调查研究、撰写——审阅与编辑。
S. Hemanna：调查研究、撰写——审阅与编辑。
S. Hofmann：调查研究、撰写——审阅与编辑。
A. Acari：调查研究、撰写——审阅与编辑。
P. Lodha：调查研究、撰写——审阅与编辑。
?.C. Sener：调查研究、撰写——审阅与编辑。
Z. Wang：调查研究、撰写——审阅与编辑。
S.A. Wohlfeil：资源提供、撰写——审阅与编辑。
C. Géraud：资源提供、撰写——审阅与编辑。
J. Utikal：资源提供、撰写——审阅与编辑。
M. Tulessin：形式分析、调查研究、方法学设计、撰写——审阅与编辑。
M. Detmar：资源提供、撰写——审阅与编辑。
C. Mogler：资源提供、方法学设计、撰写——审阅与编辑。
L.C. Dieterich：概念构思、监督指导、经费获取、撰写——原始草稿撰写、项目管理、撰写——审阅与编辑。

**致谢**

作者感谢海德堡大学曼海姆医学院的 SFB1366、FlowCore、临床前模型及活细胞成像核心平台，以及慕尼黑工业大学（TUM）的 Annett Hering 提供的卓越技术支持。作者还感谢由巴登-符腾堡州科学与艺术部及德国研究基金会（DFG）通过资助项目 INST 35/1503-1 FUGG 和 INST 35/1804-1 LAGG 支持的数据存储服务 SDS@hd。本工作直接获得德国研究基金会（DFG）以下资助项目的支持：项目编号 492531042 和 543385151（均资助 L.C. Dieterich）、575473651（L.C. Dieterich 作为共同申请人）以及 394046768（C. Mogler；协同创新研究中心 CRC1366"器官功能的血管控制"中的 Z02 项目）。

**注：** 本文的补充数据可在《癌症研究通讯》在线版（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）获取。