淋巴管PD-L1敲除降低YUMMER1肿瘤中PD-1? Th1细胞浸润

《Cancer Research Communications》：Lymphatic PD-L1 deletion reduces PD-1+ Th1 cells in the YUMMER1....

　　

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## 摘要

淋巴结（LN）驻留的淋巴管内皮细胞（LEC）构成了淋巴窦腔与淋巴结皮质之间的界面。除了参与白细胞转运外，LEC还通过清除并交叉呈递来自输入淋巴液的抗原以及组成性表达PD-L1等免疫调节蛋白来塑造免疫应答。然而，目前尚不清楚哪些免疫细胞类型和激活状态对淋巴结淋巴管的PD-L1敏感，以及淋巴管PD-L1的表达是否与癌症患者的免疫检查点阻断（ICB）敏感性相关。为了分析淋巴结淋巴管PD-L1在黑色素瘤中肿瘤免疫和ICB结局中的贡献，我们利用条件性淋巴管PD-L1敲除小鼠模型，结合ICB敏感性不同的同基因黑色素瘤模型进行研究。尽管淋巴管PD-L1缺失并未改变原发肿瘤生长、进展或引流淋巴结的整体免疫景观，但它调节了ICB敏感型而非ICB耐药型黑色素瘤的瘤内免疫组成。具体而言，淋巴管PD-L1缺失导致增殖性PD-1? CD8? T细胞频率增加，同时PD-1? Th1 T细胞减少。总之，我们的发现揭示了淋巴管PD-L1在塑造抗肿瘤T细胞应答中发挥的依赖性角色，特别是在ICB敏感性疾病中。

**意义：** 作者将免疫检查点调控的概念扩展至肿瘤微环境中的免疫细胞之外，证明在黑色素瘤引流淋巴结中的淋巴管内皮PD-L1如何调节免疫检查点敏感型黑色素瘤中的肿瘤浸润T细胞。

## 引言

免疫检查点阻断（ICB）最初被认为能够重新激活肿瘤微环境（TME）中的耗竭T细胞，恢复抗肿瘤效应功能（1）。然而，越来越多的证据表明，ICB不仅在TME内发挥作用，还在局部和全身层面发挥效应（2, 3）。尤其值得关注的是，肿瘤引流淋巴结（tdLN）已成为ICB治疗中的关键作用位点。值得注意的是，在ICB治疗前对小鼠进行淋巴结切除术会消除其治疗效果，突显了tdLN在介导治疗反应中的重要性（3, 4）。此外，将ICB局部给药至tdLN与全身治疗相比，可获得同等或更优的肿瘤控制效果（5–7）。多项研究已识别出tdLN内的早期CD8? T细胞为ICB的直接应答者（R）。这些细胞表达TCF1并维持强大的增殖和自我更新能力，从而产生大量TCF1? TOX? 祖细胞耗竭T细胞（Tpex），随后迁移至TME（3, 8）。淋巴结由多样化的免疫细胞和基质细胞群体组成，包括淋巴管内皮细胞（LEC）。有趣的是，LEC组成性表达PD-L1（CD274）等免疫检查点蛋白，但缺乏共刺激分子，提示其在外周耐受和免疫抑制中可能发挥作用（9–14）。PD-L1 mRNA在淋巴结（LN）LEC中强表达，特异性地表达于被膜下窦底部（fLEC）和髓质窦（mLEC）亚群中，而外周LEC在稳态下不表达PD-L1，仅在炎症反应中被上调（15–18）。由于其解剖位置，LN LEC与迁移和驻留的免疫细胞直接接触，包括巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞，可能影响广泛的免疫应答。我们此前已证明，在ICB敏感型结直肠癌（MC38）和ICB耐药型黑色素瘤（B16-F10）小鼠模型中，淋巴管PD-L1抑制了具有CD44? CD62L? 中央记忆表型的肿瘤抗原特异性CD8? T细胞，表明LN LEC通过表达PD-L1参与肿瘤免疫逃逸（19）。然而，淋巴管PD-L1对tdLN和TME免疫景观的确切影响，以及其与肿瘤ICB反应性的关系尚不清楚。此外，尽管小鼠和人类的LN LEC均表达PD-L1 mRNA，但人类tdLN LEC中PD-L1蛋白的存在尚未得到研究。为解决这些问题，我们使用多重免疫染色证实PD-L1在人黑色素瘤引流淋巴结的fLEC和mLEC中表达，这与ICB反应性相关，而被膜下窦（SCS）顶部LEC（cLEC）几乎不表达或完全不表达PD-L1。此外，我们利用多维流式细胞术分析，全面描绘了小鼠ICB敏感型和耐药型黑色素瘤模型中tdLN和原发肿瘤在淋巴管PD-L1缺失后的免疫学变化。尽管淋巴管PD-L1的缺失不影响肿瘤生长或进展，但我们观察到ICB敏感型肿瘤TME中的T细胞浸润发生了变化，包括增殖性PD-1? CD8? T细胞的扩增和PD-1?? Th1细胞的减少，提示抗肿瘤T细胞应答有所改善。因此，本研究为淋巴管PD-L1如何影响抗肿瘤免疫及其可能如何影响黑色素瘤ICB治疗结局提供了新的见解。

## 材料与方法

### 小鼠

本研究中所有动物实验均获得相关地区主管机构的批准（Karlsruhe行政区，许可证号G-177/22）。PD-L1LECKO小鼠由PD-L1flox小鼠（20）回交至C57BL/6N背景后与Prox1-CreERT2小鼠（21）杂交生成，其构建方法已在前文描述（19）。为匹配肿瘤细胞系的性别，使用雄性小鼠。Cre介导的重组通过腹腔注射他莫昔芬（50 mg/kg）于葵花籽油中连续五天处理7周龄小鼠启动。Cre?同窝小鼠作为对照，同样注射他莫昔芬。小鼠自由获取食物和饮水。

### 肿瘤模型

末次注射后三天，小鼠在异氟烷麻醉下经皮注射肿瘤细胞。两侧腋窝注射的细胞数量如下：YUMM1.7和YUMM5.2细胞各2 × 10?个，YUMMER1.7细胞2 × 10?个，体积为25 μL PBS。每周三次监测小鼠，通过卡尺测量评估肿瘤生长情况。当肿瘤体积达到1 cm3时，通过颈椎脱臼安乐死小鼠。通过腹腔注射FTY720（1 mg/kg，Sigma-Aldrich，货号#SML0700）或对照溶液（无菌水）实现抑制T细胞从tdLN出流。FTY720处理在接种肿瘤细胞后第7天开始，共注射三次。小鼠在接种后第10天安乐死，收集组织进行分析。

### 细胞系

YUMMER1.7细胞（RRID: CVCL_A2AX；参考文献22）由瑞士联邦理工学院苏黎世分校（瑞士苏黎世）Cornelia Halin教授于2023年慷慨提供。YUMM1.7和YUMM5.2细胞系（RRID: CVCL_JK16和CVCL_JK43；参考文献23）由海德堡大学曼海姆医学院（德国曼海姆）Jonathan Sleeman教授于2024年慷慨提供。所有细胞系均在含1%非必需氨基酸和10% FBS的DMEM/F12培养基中培养。每批实验前一周从新鲜冻存管中复苏细胞，最多传代五次。常规使用支原体PCR检测试剂盒（Abcam，货号#AB289834-1002）检测细胞系的支原体污染情况，本研究中使用的细胞均检测为阴性。由于缺乏完整的短串联重复序列参考图谱，未对细胞系进行鉴定认证。

### 组织处理

收集小鼠双侧腋窝和腹股沟引流淋巴结以及原发肿瘤。一侧腹股沟淋巴结冷冻保存用于免疫荧光分析，其余淋巴结制备用于流式细胞术分析。淋巴结处理过程中，先用针头破坏被膜，随后在含有1 mg/mL IV型胶原酶（Thermo Fisher Scientific）和40 μg/mL DNase I（Roche）的DMEM溶液（补充2% FBS和1.2 mmol/L CaCl?）中于37°C进行第一次酶消化20分钟。消化后收集上清液，残留的淋巴结碎片在含有3.5 mg/mL IV型胶原酶和40 μg/mL DNase I的DMEM溶液（补充2% FBS和1.2 mmol/L CaCl?）中于37°C进行第二次消化15分钟。所得细胞悬液通过细胞筛过滤后，重悬于FACS缓冲液（PBS中1% FBS、1 mmol/L EDTA和0.02% NaN?）中，加入抗CD16/CD32（BioLegend，货号#101302，RRID: AB_312801）后置于冰上。肿瘤组织处理过程中，将肿瘤组织切碎后，在含有3.5 mg/mL IV型胶原酶和40 μg/mL DNase I的DMEM溶液（补充2% FBS和1.2 mmol/L CaCl?）中于37°C进行酶消化30分钟。消化后的肿瘤组织过滤并通过40 μm细胞筛，细胞悬液经红细胞裂解缓冲液（0.15 mol/L NH?Cl、0.01 mol/L KHCO?和0.1 mmol/L Na?EDTA）处理。最后，将细胞重悬于含抗CD16/CD32的FACS缓冲液中置于冰上。

### 流式细胞术

细胞悬液在50 μL Brilliant染色缓冲液（BD Biosciences）中，于冰上用表面抗体（见补充表S1）染色一小时。表面染色后，使用Foxp3转录因子染色缓冲液套装（Thermo Fisher Scientific）进行细胞固定和透化过夜，随后进行胞内染色（见补充表S1）。数据采集使用NothernLight仪器（Cytek，RRID: SCR_027072）完成，数据分析使用FlowJo（v10.10.0，BD Biosciences，RRID: SCR_008520）进行。高参数流式细胞术数据分析，包括投影和聚类，按照Ingelfinger等人的方法（24）执行。未解混的流式细胞术数据在FlowJo中进行补偿处理，免疫细胞群体（CD3?CD8?、CD3?CD4?、CD3?CD19?以及CD11b?和/或CD11c?）通过手动设门筛选。尽可能每份样品导出10,000个细胞，如可用细胞数不足则纳入所有细胞。导出的细胞群体在RStudio（v4.4.2，RRID: SCR_000432）中进行分析。使用CyCombine软件包合并不同小鼠模型实验的数据。降维处理前，数据经arcsinh变换并归一化至0到1范围。使用UMAP进行可视化，采用FlowSOM算法（RRID: SCR_016899）进行无监督聚类。聚类数量根据UMAP中标志物的投影情况确定，以确保聚类具有相关性。数据可视化使用ggplot2软件包（RRID: SCR_014601）完成，统计检验采用Student t检验分析。

### tdLN免疫荧光染色与分析（小鼠）

淋巴结固定于4%多聚甲醛中2小时，PBS洗涤一次，在30%蔗糖中孵育过夜，随后包埋于最优切割温度化合物（Tissue-Tek）中并在?80°C冷冻保存。取7 μm组织切片，经PBS复水后用丙酮和80%甲醇固定。染色时，切片在含5%驴血清、1% BSA、0.05% NaN?和0.1% Triton X-100的PBS阻断液中孵育1小时。随后在相同阻断液中加入一抗孵育一小时。所用一抗为兔抗BRAFV600E（Thermo Fisher Scientific，货号#MA5-24661，RRID: AB_2661889）和抗CD45-生物素（BioLegend，货号#103104，RRID: AB_312969）。洗涤后，切片用驴抗兔AF594（Thermo Fisher Scientific，货号#A-21207，RRID: AB_141637）、链霉亲和素-AF488（BioLegend，货号#405235）和Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，货号#H3569，RRID: AB_2651133）在PBS中孵育一小时。切片经洗涤、封片后，使用Axioscan 7（Zeiss）扫描仪成像。为定量YUMM5.2、YUMM1.7和YUMMER1.7引流淋巴结中BRAFV600E?转移灶面积，选取间隔约100 μm的多张淋巴结切片进行CD45和BRAFV600E染色，以非引流淋巴结作为对照。使用合并的免疫荧光通道识别CD45?/BRAFV600E?细胞簇。对手动勾画的转移区域进行颗粒分析，结果根据预先定义的兴趣区域（ROI）尺寸进行标准化，该ROI覆盖整个淋巴结横截面。

### 福尔马林固定石蜡包埋人黑色素瘤引流淋巴结的多重成像

本研究使用人样本已获得慕尼黑工业大学（TUM）伦理委员会批准（批准号：2022-140-1-S-KH），以及德国海德堡大学第二伦理委员会批准（批准号2010-318N-MA和2014-835R-MA）。根据《赫尔辛基宣言》，每位捐赠组织的个人均获得书面知情同意。三例患者在TUM病理科收集的局部区域转移性黑色素瘤引流淋巴结的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片经脱蜡和复水后，分别使用EDTA或柠檬酸盐缓冲液进行表位修复。使用PhenoCycler仪器（Akoya Biosciences，RRID: SCR_023773）进行多重荧光染色，使用兔抗PROX1（Abcam，货号#ab199359，RRID: AB_2868427）、鼠抗podoplanin（Agilent，货号#M3619，RRID: AB_2162081）、兔抗PRAME（Cell Signaling Technology，货号#56426，RRID: AB_2799510）、兔抗NT5E（Cell Signaling Technology，货号#13160，RRID: AB_2716625）和兔抗PD-L1（Cell Signaling Technology，货号#13684，RRID: AB_2687655），随后使用相应的OPAL检测试剂。图像使用QuPath（RRID: SCR_018257）进行分析。选取的兴趣区域（ROI）包括淋巴结总面积（排除转移区域）和被膜下窦（SCS）区域。

随后，通过检测PROX1阳性核并设定针对该淋巴结切片的特定荧光强度阈值来识别LEC。在每个检测到的核周围扩展2 μm的周边区域，以包含周围的胞质区域。核检测参数设置为最小面积1 μm2、最大面积1,000 μm2，以及sigma值为2 μm。对于每个PROX1阳性事件，导出所有相关通道的平均荧光强度。在R中，导出的值根据CD73和podoplanin（D2-40）的强度被归类为LEC亚群，每个标志物的阈值针对每个淋巴结切片单独定义。PD-L1平均表达值以双阴性（CD73? podoplanin?）亚群为基准进行标准化，然后使用GraphPad Prism在各亚群间进行分析。为了量化应答者（R）和非应答者（NR）患者黑色素瘤引流淋巴结中的淋巴PD-L1，我们对10名患者收集的黑色素瘤引流淋巴结FFPE切片进行了染色[n = 6（NR）vs. n = 4（R）]，这些患者接受了辅助性nivolumab（抗PD-1）治疗，部分患者还同时接受了ipilimumab（抗CTLA4）治疗（补充表S2）。载玻片先在60°C下烘烤30分钟，然后经过二甲苯和乙醇浴的依次脱蜡步骤。载玻片随后在Tris-EDTA（pH 9）抗原修复缓冲液中以97°C孵育10分钟，并在缓冲液中冷却20分钟后再进行封闭步骤。载玻片随后进行claudin-5（Thermo Fisher Scientific，产品号#35-2500，RRID：AB_2533200）和PD-L1（Cell Signaling Technology，产品号#13684，RRID：AB_2687655）染色，随后加入相应的二抗[驴抗小鼠AF594（Thermo Fisher Scientific，产品号#A-11005，RRID：AB_2534073）、驴抗兔AF647（Thermo Fisher Scientific，产品号#A-31573，RRID：AB_2536183）]以及Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，产品号#H3569，RRID：AB_2651133）。最后，切片进行封片并使用STELLARIS 8共聚焦显微镜（Leica Microsystems，RRID：SCR_024664）扫描。图像使用Fiji（RRID：SCR_002285；参考文献25）进行分析。为了量化淋巴管上的PD-L1，绘制了包围整个淋巴结区域的ROI和SCS区域下方的ROI。在定量分析之前，清除图像中的外部区域、受损区域和染色伪影。然后将图像分割为单独的荧光通道。在调整和应用于claudin-5通道适当阈值之后，创建二值图像并使用腐蚀和膨胀函数进行处理，以生成合并血管结构的掩模。最后，选择大于50 μm2的结构并投影到PD-L1通道上以测量其平均PD-L1染色强度。使用这种方法分别分析SCS区域和髓质/皮质区域。PD-L1染色强度明显低至缺失的区域用于确定背景信号。癌症基因组图谱数据分析

淋巴结CD274表达与黑色素瘤患者总生存期的相关性[皮肤切面黑色素瘤（SKCM）队列]使用UCSC Xena浏览器（RRID：SCR_018938；参考文献26）进行了调查。中位表达水平用作截断值，将患者分为低表达和高表达组。统计分析使用log-rank检验。

统计学

GraphPad Prism（v10.2.3，RRID：SCR_002798）和RStudio（v4.4.2，RRID：SCR_000432）用于统计学检验。统计学显著性在图中标注星号；未显示显著性标注的比较不具有统计学显著性。每项实验的统计学检验方法和结果包含在图注中。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。在FTY720研究中，一只Cre?小鼠因在肿瘤T细胞浸润方面被ROUT方法（Q = 1%）识别为异常值而被排除。

结果

fLECs和mLECs在人黑色素瘤引流淋巴结中表达PD-L1

在小鼠淋巴结中，已在稳态和病理条件下证明了fLECs和mLECs在mRNA和蛋白质水平的组成型PD-L1表达。与此一致，癌症患者无转移淋巴结的单细胞RNA测序确认了mLEC和fLECs中的PD-L1转录本（27, 28）。然而，人淋巴结中淋巴PD-L1在蛋白质水平的表达此前尚未被证明。因此，我们建立了一套多重免疫荧光染色方案，用于检测黑色素瘤患者tdLNs中的淋巴PD-L1表达（图1A）。我们纳入了PROX1作为泛LEC标志物、CD73（NT5E）作为cLEC标志物，以及podoplanin（D2-40），广泛表达于外周LEC中（27）。此外，我们标记了黑色素瘤标志物PRAME以检测转移。在一小组黑色素瘤患者（N = 3，补充表S2；图1A）获得的淋巴结中，PROX1阳性核清晰可辨。我们注意到许多LEC既不表达CD73也不表达podoplanin，而一些LEC为单阳性或双阳性。值得注意的是，CD73忠实染色SCS区域的cLECs，但在整个淋巴结范围内不是可靠的cLEC标志物。在单个淋巴窦内可观察到异质性表达，其中一些LEC表达podoplanin，而其他LEC为CD73?，即使在淋巴结皮质深层也是如此（图1A）。与CD73和podoplanin的表达模式相对应，PD-L1表达在LEC中表现出相当大的异质性，显示个体PD-L1?和PD-L1? LEC有时甚至在同一淋巴窦横截面中（白色箭头所示，图1A）。

图1. 查看大图 下载幻灯片 人黑色素瘤引流淋巴结中淋巴结LEC的PD-L1表达。A，人黑色素瘤引流淋巴结中CD73（红色）、PROX1（绿色）、PD-L1（粉色）、podoplanin（D2-40，浅蓝色）、PRAME（黄色）和核（蓝色）免疫荧光染色的代表性显微镜图像。放大视图显示了SCS和皮质区域的代表性区域。B，根据CD73和podoplanin定义的PROX1阳性LEC亚群（>2,000/患者）在总淋巴结区域和SCS区域中PD-L1平均荧光强度的定量分析，强度以双阴性（DN）亚群为基准标准化。N = 3名患者。**，P < 0.01；单因素ANOVA配?ídák事后检验。PODO，podoplanin。C，CD274基因表达与总生存期相关性的人黑色素瘤数据（SKCM-癌症基因组图谱数据集，按切除/活检部位为淋巴结进行筛选）的Kaplan-Meier曲线。使用中位基因表达值作为截断值。统计分析使用log-rank检验。D，用claudin-5和PD-L1染色的黑色素瘤患者代表性tdLN的免疫荧光图像。E，代表性NR和R患者黑色素瘤引流淋巴结SCS区域的放大视图。F，根据claudin-5阳性血管结构在SCS区域和淋巴结内部区域PD-L1平均荧光强度的定量分析，以低PD-L1水平背景为基准标准化。N = 4-6名患者/组。Student t检验。

对于定量分析，根据PROX1染色在整个人淋巴结横截面或仅在SCS区域中选择单个LEC核（补充图S1A和S1B），并以围绕这些核的扩展区域作为LEC细胞体的替代。然后我们根据CD73和podoplanin的表达将LEC分为四个表型亚群，并确定每个亚群中PD-L1的平均荧光强度。当考虑整个淋巴结区域时，在四个LEC亚群之间未检测到标准化PD-L1染色强度的显著差异，尽管三个淋巴结中有两个显示CD73? podoplanin? LEC的PD-L1表达较低（图1B；补充图S1A）。相反，在SCS区域内，双阴性（CD73和podoplanin均为阴性）的fLECs中一致观察到PD-L1表达，而CD73? podoplanin? cLECs显示出相当低的PD-L1表达。所有三名患者的基于强度的定量分析确认，SCS cLECs（CD73? podoplanin?）的PD-L1染色强度比CD73?亚群低约三倍（图1B；补充图S1B）。总之，这些数据表明，PD-L1在人黑色素瘤引流淋巴结中在蛋白质水平上由LEC表达，其中CD73? SCS cLECs表现出低至无PD-L1，与fLECs和淋巴结皮质中的其他LEC形成对比，这与小鼠淋巴结LEC中PD-L1的表达模式相呼应。

PD-L1/PD-1通路是黑色素瘤免疫检查点阻断（ICB）治疗的既定靶点，但只有一部分患者对ICB表现出持久应答。为了调查淋巴PD-L1表达与ICB疗效之间的潜在关系，我们首先从癌症基因组图谱数据库中提取了淋巴结PD-L1（由CD274基因编码）表达与皮肤黑色素瘤患者生存数据，发现高PD-L1表达与良好预后之间存在强相关性（图1C）。由于bulk RNA测序无法区分包括LEC在内的单个细胞类型的PD-L1表达，我们接下来对我们中心治疗的、对辅助性nivolumab（抗PD-1）治疗有应答或无应答的一小组黑色素瘤患者的tdLN切片进行染色（补充表S2）。PD-L1表达在通过泛内皮标志物claudin-5识别的血管结构内进行量化（图1D；补充图S1C；参考文献29）。有趣的是，当我们分析claudin-5阳性血管结构主要对应淋巴窦的SCS区域时，与NR相比，ICB-R患者这些claudin-5阳性血管内的PD-L1染色强度倾向于高约20%（无显著性，图1E和F）。当我们分析淋巴结皮质和淋巴结内部区域时，也观察到相似的、无统计学显著性的趋势，即ICB-R患者PD-L1表达增加（图1F）。如果在更大的患者队列中得到证实，这些结果可能表明淋巴PD-L1表达与黑色素瘤患者的ICB应答性相关。然而，我们对淋巴结内部区域和皮质区域的分析可能也包括血管内皮，而且患者队列规模太小，无法确定统计学显著性。

淋巴PD-L1缺失不影响小鼠黑色素瘤的生长或进展

在确认淋巴结LEC在黑色素瘤患者中表达PD-L1后，我们接下来使用临床上相关的黑色素瘤小鼠模型研究了LEC表达的PD-L1在肿瘤免疫中的作用。为此，我们选择了三种携带人黑色素瘤中常见突变的同基因黑色素瘤模型：YUMM5.2（BrafV600E/wt，P53?/?）、YUMM1.7（BrafV600E/wt，Pten?/?，Cdkn2a?/?）和YUMMER1.7（22, 23），后者是YUMM1.7的紫外线诱导体细胞超变异衍生株，因其突变异质负荷增加而被描述为ICB敏感，而YUMM1.7和YUMM5.2则对ICB耐药（22, 30）。因此，这组黑色素瘤模型使我们能够在不同的ICB应答性条件下评估淋巴PD-L1的影响，模拟了黑色素瘤中ICB疗效的临床多样性。肿瘤细胞皮下注射到经他莫昔芬处理的PD-L1fl/fl × Prox1-CreERT2小鼠（PD-L1LECKO小鼠）两侧，并监测肿瘤生长直到第一只小鼠达到1 cm3的肿瘤体积（图2A）。流式细胞术在研究终点时确认了淋巴结LEC上有效的PD-L1缺失，且未影响其频率（图2B；补充图S2A和S2B）。值得注意的是，与我们之前使用B16-F10黑色素瘤模型的结果类似（19），缺失淋巴结LEC表达的PD-L1未影响任何所测黑色素瘤模型的原发肿瘤生长（图2C）。

接下来，我们使用针对YUMM细胞系BRAFV600E突变的抗体联合CD45，检测了各黑色素瘤模型中相应肿瘤引流淋巴结（tdLNs）的转移发生情况（图2D和E）。在各模型中，YUMM5.2的转移负荷最高，而YUMM1.7和YUMMER1.7细胞系显示出相似但较低的水平。淋巴管内皮细胞（LEC）表达的PD-L1缺失并未改变任何模型中tdLN转移的发生（图2E）。

**图2.** 放大图 | 下载幻灯片：淋巴管PD-L1不影响黑色素瘤肿瘤生长或tdLN转移。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠连续五天接受他莫昔芬治疗，然后通过皮内（ID）接种同基因型黑色素瘤细胞（箭头所示）。当肿瘤体积达到1 cm3时，处死小鼠。B，他莫昔芬处理的PD-L1LECKO小鼠的YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2引流淋巴结中LEC（CD45? podoplanin? CD31?）及PD-L1? LEC的频率。****，P < 0.0001；双因素方差分析（ANOVA）联合?ídák事后检验。C，YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2在他莫昔芬处理的PD-L1LECKO小鼠中的肿瘤生长曲线。通过游标卡尺测量监测肿瘤生长。N = 每组4–7只小鼠。D，黑色素瘤小鼠模型引流淋巴结中BRAFV600E（红色）、CD45（绿色）和细胞核（蓝色）的代表性免疫荧光染色显微镜图像。仅显示Cre-组。箭头指示转移结节。E，初始淋巴结和黑色素瘤引流淋巴结中转移面积的定量分析。N = 每组4–7个淋巴结。虚线表示使用初始淋巴结获得的本底染色。Student t检验。

**图3.** 放大图 | 下载幻灯片：淋巴管PD-L1缺失增加ICB敏感黑色素瘤中增殖的PD-1? T细胞。为表征靶向淋巴管PD-L1缺失后tdLNs和原发肿瘤中的免疫景观，我们在研究终点收集这些组织并进行深入的流式细胞术分析。首先，我们手动门控tdLNs和原发肿瘤中的CD8?和CD4? T细胞群体（补充图S3A）。尽管YUMMER1.7肿瘤的肿瘤浸润CD8? T细胞数量最高，但在淋巴管PD-L1缺失后，tdLNs中CD8?或CD4? T细胞计数以及肿瘤微环境（TME）中均未见显著变化（图3A；补充图S3B）。同样，Foxp3?调节性T细胞（Treg）和辅助性T细胞（Th）的相对频率也未观察到显著差异（补充图S3C）。为深入解析淋巴管PD-L1缺失后tdLNs和原发肿瘤中的T细胞组成，我们应用了高维流式细胞术，包括T细胞亚群、激活和耗竭状态标记物，随后进行无监督聚类。在tdLNs中，我们鉴定出11个CD8? T细胞簇（图3B和C）。在所有黑色素瘤模型中，CD8? T细胞的主要簇为CD44? TCF1?干性样T细胞簇（簇2）和两个初始CD8? T细胞簇（簇3和4；图3C和D）。值得注意的是，与YUMM1.7和YUMM5.2引流淋巴结相比，YUMMER1.7引流淋巴结中增殖的CD62L? PD-1???? T细胞（簇1）比例高出四到五倍，且在淋巴管PD-L1缺失后有进一步增加的趋势（图3D和E）。在TME中，我们鉴定出12个浸润性CD8? T细胞簇（图3F和G）。在原发YUMMER1.7肿瘤中，与之匹配的增殖性CD62L? PD-1???? T细胞（簇1）群体频率再次高于其他模型（约2–3倍），并且在淋巴管PD-L1缺失后显著进一步增加（图3H和I）。此外，PD-1?? TOX??耗竭T细胞簇（簇10）在YUMMER1.7肿瘤TME中较其他模型明显增加，但未受淋巴管PD-L1缺失的显著影响（图3H）。总之，这些发现表明，在YUMMER1.7模型中，淋巴管PD-L1缺失可能促进tdLNs中增殖CD8? T细胞的增殖和/或流出，促进其向TME转移并在其中分化为耗竭T细胞。或者，表达PD-L1的肿瘤相关LEC可能直接减少TME内的T细胞增殖。然而，淋巴管PD-L1耗竭后该T细胞亚群在TME中增强的积累尚不足以减少YUMMER1.7模型的原发肿瘤生长。相反，ICB耐药黑色素瘤中的T细胞几乎不受淋巴管PD-L1缺失的影响。

**图3.** A，YUMMER1.7、YUMM1.7和YUMM5.2黑色素瘤模型tdLNs中每个淋巴结的CD8?和CD4? T细胞平均计数以及每毫克原发肿瘤组织的计数。N = 每组4–7只小鼠。双因素方差分析联合?ídák事后检验。B，tdLNs中CD8? T细胞的UMAP无监督聚类及各模型和条件的单个UMAP图。C，描绘所有簇平均标记物表达的热图。D，tdLNs中CD8? T细胞各簇在指定处理下频率的热图。E，通过经典流式细胞术门控确定的指定条件下tdLNs中Ki67? CD62L? CD44? PD-1? CD8? T细胞（簇1）的频率。N = 每组4–7只小鼠。双因素方差分析联合?ídák事后检验。F，TME中CD8? T细胞的UMAP无监督聚类及各模型和条件的单个UMAP。G，描绘所有簇平均标记物表达的热图。H，TME中CD8? T细胞各簇在指定处理下频率的热图。*，P < 0.05；Student t检验。I，通过经典流式细胞术门控确定的指定条件下TME中Ly6C? Ki67? CD62L? PD-1? CD8? T细胞（簇1）的频率。N = 每组4–7只小鼠。*，P < 0.05；双因素方差分析联合?ídák事后检验。APO，apotracker；Tex，耗竭T细胞；Tpex，祖细胞耗竭T细胞。

**图4.** 放大图 | 下载幻灯片：淋巴管PD-L1缺失特异性减少YUMMER1.7原发肿瘤中的PD-1? Th1细胞。已有研究表明，LEC可表达MHC-I分子并影响自身反应性和肿瘤特异性CD8? T细胞（9, 19）。此外，LEC还表达MHC-II分子，尽管尚不清楚它们是否能自行装载外源肽，而是从其他细胞获取肽-MHC-II复合物（12, 31, 32）。尽管如此，先前的研究表明，LEC的MHC-II表达通过阻碍CD4? T细胞的增殖和存活以及激活Treg而导致CD4? T细胞功能障碍（12, 32）。因此，我们调查了淋巴管PD-L1缺失是否影响tdLNs和原发肿瘤中的CD4? T细胞亚群。在tdLNs中，CD4? T细胞的无监督聚类产生了10个不同的簇，包括一个主要的初始CD4? T细胞簇（簇1），该簇未表现出向任何定义的CD4? Th亚群极化的特征（图4A–C）。无论是这一簇还是任何其他簇，包括Treg、增殖性CD4? T细胞和Th17细胞，均未受淋巴管PD-L1缺失的影响（图4A–C）。相反，在TME中，浸润性CD4? T细胞的无监督聚类产生了10个簇，其中Foxp3? Treg（簇3、5、6、8、9和10）和PD-1?? Th1 T细胞簇（簇7）代表了主要的CD4? T细胞群体（图4D–F）。有趣的是，在YUMMER1.7肿瘤中，淋巴管PD-L1缺失特异性地使这一PD-1?? Th1 T细胞簇（簇7）减少了约20%（图4E–G）。这一发现提示淋巴管PD-L1在维持TME内PD-1?? Th1细胞方面可能具有潜在作用。

**图4.** A，tdLNs中CD4? T细胞的UMAP无监督聚类及各黑色素瘤模型和条件的单个UMAP。B，描绘所有簇平均标记物表达的热图。C，tdLNs中CD4? T细胞各簇在指定处理下频率的热图。D，TME中CD4? T细胞的UMAP无监督聚类及各黑色素瘤模型和条件的单个UMAP。E，描绘所有簇平均标记物表达的热图。F，TME中CD4? T细胞各簇在指定处理下频率的热图。*，P < 0.05；Student t检验。G，通过经典流式细胞术门控确定的指定条件下TME中PD-1? CD44? Foxp3? CD4? T细胞（簇7）的频率。N = 每组4–7只小鼠。*，P < 0.05；Student t检验。APO，apotracker。

**图4. 淋巴管PD-L1缺失不影响tdLNs和TME中的髓系和B细胞群体**

除了T细胞外，淋巴结和TME中还含有大量B细胞和多样化的髓系细胞亚群。尽管某些免疫细胞是淋巴结的常驻细胞，但许多细胞从外周组织迁移至引流淋巴结，在其中发挥启动和调节适应性免疫应答的关键作用。最近有证据表明PD-1在B细胞和髓系细胞群体中均有表达（33–35）。

这表明淋巴管内皮细胞（LECs）表达的PD-L1原则上可以调节T细胞以外的各种免疫细胞类型的活性。因此，我们分析了免疫检查点阻断（ICB）敏感和耐药黑色素瘤模型中肿瘤引流淋巴结（tdLNs）和原发肿瘤的B细胞和髓系细胞群体，以确定淋巴管PD-L1缺失是否影响它们的组成或表型。在淋巴管PD-L1缺失后，tdLNs和原发肿瘤中髓系细胞的频率和数量未受影响（补充图S4A和S4B）。同样，尽管对tdLNs和原发肿瘤中双阳性或单阳性CD11b+和CD11c+（CD11b+/CD11c+）髓系细胞进行无监督聚类的深入流式细胞术分析表明，YUMMER1.7肿瘤微环境（TME）被粒细胞大量浸润（群4），但在淋巴管PD-L1耗竭后未观察到差异（补充图S4C-S4H）。与固有髓系细胞类似，tdLNs和TME中的整体B细胞群体不受淋巴管PD-L1耗竭的影响（补充图S5A和S5B）。对tdLNs中CD19+ B细胞图谱进行无监督聚类定义了10个群，其中一个主要的B细胞群高表达激活标志物（CD80, CD86）和主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）（补充图S5C和S5D）。然而，淋巴管PD-L1缺失后没有任何B细胞群发生改变（补充图S5E）。在TME内，B细胞的频率过低，无法进行更深入的分析（补充图S5B）。总体而言，这些结果表明淋巴管PD-L1不影响tdLNs和原发肿瘤内髓系或B细胞群体的组成或表型分布。

淋巴管PD-L1对tdLNs中增殖性PD-1+ T细胞的局部调节
为了确定淋巴管PD-L1是否通过干扰tdLNs内的迁移或扩增从而影响CD8+ T细胞向TME的募集，或者肿瘤相关淋巴管中的PD-L1是否在TME内局部抑制了CD8+ T细胞，我们使用FTY720阻断了携带YUMMER1.7的PD-L1LECKO小鼠tdLNs中的淋巴细胞转运（图5A）。肿瘤生长未受该治疗的影响（补充图S6A）。在终点，我们采集tdLNs和肿瘤以评估迁出阻断对这些器官内T细胞群体的影响。
图5。查看大图 下载幻灯片 淋巴管PD-L1调节YUMMER1.7引流淋巴结内增殖的CD44+ CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠连续五天接受他莫昔芬处理，然后皮下接种YUMMER1.7黑色素瘤细胞（由箭头指示）。在第7、8和9天，小鼠接受腹腔注射（IP）FTY720，然后在第10天处死。B和C，在所示处理下，YUMMER1.7黑色素瘤模型tdLNs（B）和原发肿瘤（C）中每淋巴结或每毫克肿瘤的CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Ki67+ CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞的数量。N = 3–5只/组。*, P < 0.05; **, P < 0.01; 单因素方差分析并带有?ídák事后检验。D，假定的作用模式示意图。在Cre小鼠（上）中，tdLNs中LECs表达的PD-L1抑制早期激活的CD8+ T细胞的激活、增殖或淋巴结迁出，限制其在TME内的迁移和积累。在缺乏淋巴管PD-L1表达的Cre+小鼠中，tdLNs中早期激活的CD8+ T细胞输出增强，导致TME浸润增加。BV，血管；LV，淋巴管。
图5。查看大图 下载幻灯片 淋巴管PD-L1调节YUMMER1.7引流淋巴结内增殖的CD44+ CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞。A，研究设计概述。PD-L1LECKO小鼠连续五天接受他莫昔芬处理，然后皮下接种YUMMER1.7黑色素瘤细胞（由箭头指示）。在第7、8和9天，小鼠接受腹腔注射（IP）FTY720，然后在第10天处死。B和C，在所示处理下，YUMMER1.7黑色素瘤模型tdLNs（B）和原发肿瘤（C）中每淋巴结或每毫克肿瘤的CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Ki67+ CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞的数量。N = 3–5只/组。*, P < 0.05; **, P < 0.01; 单因素方差分析并带有?ídák事后检验。D，假定的作用模式示意图。在Cre小鼠（上）中，tdLNs中LECs表达的PD-L1抑制早期激活的CD8+ T细胞的激活、增殖或淋巴结迁出，限制其在TME内的迁移和积累。在缺乏淋巴管PD-L1表达的Cre+小鼠中，tdLNs中早期激活的CD8+ T细胞输出增强，导致TME浸润增加。BV，血管；LV，淋巴管。
关闭图5。
与预期一致，FTY720治疗增加了tdLNs中CD3+ T细胞的数量，这与有效阻断淋巴细胞迁出一致（图5B）。这种增加是由CD4+和CD8+ T细胞的积累驱动的，因为FTY720治疗后这两个亚群的数量均升高（图5B）。相比之下，FTY720治疗后tdLNs中T细胞的相对频率仅轻微增加（补充图S6B）。有趣的是，对缺乏淋巴管PD-L1的小鼠进行FTY720治疗，与Cre阴性对照相比，导致tdLNs中CD3+、CD4+和CD8+ T细胞出现更大程度、高达两倍的积累（图5B）。与此同时，对缺乏淋巴管PD-L1的小鼠进行FTY720治疗，减少了TME中CD3+、CD4+和CD8+ T细胞的数量（图5C）。接下来，我们检查了FTY720治疗对这些器官中增殖性CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞亚群的影响。在阻断淋巴结迁出后，无论是否缺失淋巴管PD-L1，我们都观察到这一特定T细胞亚群在YUMMER1.7引流淋巴结中显著积累，增加了两到三倍，证实这些细胞在淋巴结内增殖和/或积累并被阻止迁出（图5B；补充图S6B）。相反，在TME内，无论是否缺失淋巴管PD-L1，FTY720治疗后增殖性CD62L+ CD44+ PD-1+ CD8+ T细胞的数量均减少（图5C；补充图S6C）。因此，淋巴管PD-L1缺失后，该特定T细胞亚群在TME内的扩增取决于淋巴结中T细胞的持续输入。总体而言，我们的发现与一种模型相符，即淋巴管PD-L1主要调节tdLNs内肿瘤特异性T细胞激活的早期步骤，并对其在TME中的积累产生下游影响（图5D）。

讨论
在本研究中，我们确认人类黑色素瘤引流淋巴结中的LECs表达PD-L1蛋白。我们发现fLECs具有一致的PD-L1表达，淋巴结皮质中的LECs表达更具异质性，而被膜下窦（SCS）收集管淋巴管内皮细胞（cLECs）显示出极少的PD-L1染色，与小鼠淋巴结中的表达模式相匹配。然而，我们的定量方法存在局限性，因为我们无法使用染色面板中的标志物忠实地识别所有LEC亚群的全部细胞体。尽管PROX1染色允许非常特异性地识别LEC细胞核，但由于它们在组织切片中呈细长且不规则的形态，我们大概只量化了属于每个LEC的PD-L1染色的相当一部分。此外，用于区分人类淋巴结中LEC亚群的可靠标志物缺乏。CD73已被提出作为cLEC标志物（27），但我们发现淋巴结皮质/髓质中有大量LEC也呈CD73+，这使单个LEC的亚群归属变得复杂。同样，能在皮肤和其他组织中有效染色LEC的podoplanin在淋巴结中显示出断续、斑片状染色。为了准确量化人类淋巴结切片中主要LEC亚群上的PD-L1表达，识别可靠的、亚群特异性的LEC标志物以进行共染色将是必不可少的。有趣的是，在少数黑色素瘤患者队列中，淋巴结淋巴管PD-L1表达与辅助ICB反应性相关，这一发现可能会促使进一步研究以确定淋巴管PD-L1表达在ICB治疗背景下的潜在预测价值。然而，需要对大得多的患者队列进行评估，以确定淋巴管PD-L1水平是否适合作为黑色素瘤患者ICB的预测生物标志物。

为了更好地理解淋巴管PD-L1的功能相关性，我们在小鼠中遗传性敲除淋巴管PD-L1后，对ICB敏感（YUMMER1.7）和耐药（YUMM1.7和YUMM5.2）黑色素瘤模型中tdLNs和原发肿瘤的免疫图谱进行了深入全面的表征。尽管淋巴管PD-L1的缺失并没有减少原发黑色素瘤的生长或转移，但我们观察到仅在ICB敏感的YUMMER1.7模型中对肿瘤T细胞浸润产生了显著影响，其特征是增殖性CD62L+ PD-1+ CD8+ T细胞的积累以及PD-1hi Th1细胞的减少。tdLNs中的早期CD8+ T细胞，特别是干样和Tpex细胞，已被确定为ICB疗效的介导者。在PD-L1/PD-1阻断后，这些细胞扩增并迁移至肿瘤，为TME内的耗竭性T细胞池提供燃料（3, 8, 36, 37）。我们的结果与一种模型相符，即淋巴管PD-L1限制此类CD8+ T细胞向TME迁移的淋巴结输出，发生在具有高突变负荷且存在大量可用于识别的肿瘤相关抗原的“热”ICB敏感黑色素瘤中。相反，在ICB耐药的黑色素瘤中，淋巴管PD-L1对肿瘤免疫不起显著调节作用，这可能是由于肿瘤相关抗原稀少，且淋巴结LECs对其交呈递有限。在tdLNs内，我们仅观察到淋巴管PD-L1缺失对CD8+ T细胞图谱的边缘效应，而我们此前曾证明淋巴管PD-L1促进tdLNs中肿瘤抗原特异性CD44+ CD62L+ CD8+ T细胞的扩增（19）。由于YUMM黑色素瘤模型是非黑色素性的，且免疫优势肿瘤抗原未知，在本研究中我们只能表征tdLNs中的整体CD8+区室，从而遗漏了淋巴管PD-L1对单个肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞克隆的潜在影响。此外，淋巴管PD-L1可能会特别影响穿越皮质淋巴管内皮并通过输出淋巴管离开tdLNs的T细胞，这将导致与tdLNs相比，TME中的T细胞图谱发生更明显的重塑。与该假设一致，我们观察到使用FTY720阻断tdLNs中的淋巴细胞迁出，与对照组相比，导致缺乏淋巴管PD-L1的小鼠中T细胞积累加剧。也许FTY720介导的S1P信号阻断会导致T细胞滞留于淋巴窦附近，延长其暴露于淋巴管PD-L1的时间，后者抵消了它们的激活或增殖。然而，要证实这一假设，仍需进行额外实验以精确绘制tdLNs内单个T细胞亚群的定位以及PD-L1/PD-1相互作用的图谱。

除了CD8+ T细胞外，我们的数据显示，与ICB耐药模型相比，在ICB敏感的YUMMER1.7模型的原发肿瘤中，淋巴管PD-L1缺失后，一个PD-1hi Th1亚群减少了。尽管LECs获取抗原负载的MHC-II分子的机制尚不完全清楚，但先前的研究表明LECs可以通过MHC-II损害CD4+ T细胞的增殖和存活（12, 32）。潜在地，IFNγ（据报道由于高CD8+ T细胞浸润而在YUMMER1.7 TME中大量存在的细胞因子（38））可能会诱导该模型中LECs上的MHC-II上调，从而有利于LEC-CD4 T细胞相互作用（32）。然而，淋巴管PD-L1调节PD-1hi Th1细胞的具体机制以及这种相互作用对肿瘤免疫的潜在影响无法在我们的研究中得到解决。淋巴结LECs以相当高的水平组成性表达PD-L1。相比之下，外周LECs（如真皮LEC）通常缺乏PD-L1，但可以在IFNγ刺激下上调其表达，这在肿瘤相关淋巴管中已观察到（17, 18）。由于肿瘤相关淋巴管通常很少，我们无法评估在我们的小鼠模型中TME内LECs上的PD-L1是否被有效敲除。无论如何，我们不能排除肿瘤相关LECs上的PD-L1缺失直接影响了TME内T细胞的频率或激活状态，特别是那些通过淋巴系统向tdLNs回流的细胞。然而，我们在FTY720治疗后获得的结果表明，TME内对淋巴管PD-L1缺失发生改变的T细胞图谱主要是由于tdLN T细胞输出的差异造成的。综上所述，我们的数据显示，淋巴管PD-L1是调节黑色素瘤引流淋巴结中早期T细胞激活的重要因素，并且可能与黑色素瘤患者的ICB反应性相关。

数据可用性
支持本研究结果的数据可在本文、补充文件或向通讯作者提出合理请求时获得。

作者利益声明

S.A. Wohlfeil 报告在本文工作之外，从布里斯托-梅耶尔·史格公司（Bristol Myers Squibb）和默克雪兰诺公司（Merck Sharp & Dohme）获得个人费用，从皮埃尔法布勒公司（Pierre Fabre）获得非资金支持，以及从太阳制药公司（Sun Pharma）获得个人费用和非资金支持。

J. Utikal 在本文工作之外，担任安进公司（Amgen）、布里斯托-梅耶尔·史格公司（Bristol Myers Squibb）、葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline）、免疫核心公司（Immunocore）、力奥制药公司（Leo Pharma）、默克雪兰诺公司（Merck Sharp and Dohme）、诺华公司（Novartis）、皮埃尔法布勒公司（Pierre Fabre）、细胞反应器公司（Rheacell）、罗氏公司（Roche）和赛诺菲公司（Sanofi）的顾问委员会成员，或从上述公司获得酬金和差旅支持。

M. Tulessin 无利益冲突需披露。

其他作者未报告任何利益冲突。

作者贡献

E. Reynaud：概念化、数据管理、形式分析、调查研究、可视化、方法论、初稿撰写、审阅与编辑。

S. Belherazem：形式分析、调查研究、审阅与编辑。

S. Hemanna：调查研究、审阅与编辑。

S. Hofmann：调查研究、审阅与编辑。

A. Acari：调查研究、审阅与编辑。

P. Lodha：调查研究、审阅与编辑。

?.C. Sener：调查研究、审阅与编辑。

Z. Wang：调查研究、审阅与编辑。

S.A. Wohlfeil：资源支持、审阅与编辑。

C. Géraud：资源支持、审阅与编辑。

J. Utikal：资源支持、审阅与编辑。

M. Tulessin：形式分析、调查研究、方法论、审阅与编辑。

M. Detmar：资源支持、审阅与编辑。

C. Mogler：资源支持、方法论、审阅与编辑。

L.C. Dieterich：概念化、监督、资金获取、初稿撰写、项目管理、审阅与编辑。

致谢

作者感谢海德堡大学曼海姆医学院的SFB1366、流式核心设施、临床前模型核心设施和活细胞成像核心设施，以及慕尼黑工业大学（TUM）的Annett Hering提供的卓越技术支持。

作者还感谢巴登-符腾堡州科学、研究和艺术部及德国研究基金会（DFG）通过INST 35/1503-1 FUGG和INST 35/1804-1 LAGG项目资助的SDS@hd数据存储服务。

本工作直接得到了德国研究基金会（DFG）的资助支持，项目编号为492531042和543385151（均由L.C. Dieterich负责）、575473651（L.C. Dieterich作为联合申请人）以及394046768（C. Mogler；CRC1366"器官功能的血管控制"项目中的Z02子项目）。

注：本文的补充数据可在《癌症研究通讯》在线版（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）获取。