松果菊苷通过NGF/PI3K/PKCδ/Src信号通路减轻单侧输尿管梗阻诱导的肾纤维化

《Science Progress》：Echinacoside attenuates unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis through NGF/PI3K/PKCδ/Src signaling

　　

摘要 目的：肾纤维化（renal fibrosis）是导致慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）的常见不可逆病理过程。松果菊苷（Echinacoside, Ech）具有肾脏保护特性，但其抗肾纤维化的详细调控机制尚不明确。本研究旨在探讨Ech对肾纤维化的治疗作用，并进一步阐明其潜在分子机制。 方法：建立单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）小鼠模型，术后研究人员给予小鼠腹腔注射Ech（20或40 mg/kg/天）。采用H&E、Masson、天狼星红（Sirius Red）及TUNEL染色评估肾损伤与肾小管凋亡。通过RT-qPCR和免疫荧光检测炎症因子、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）及细胞外基质（extracellular matrix, ECM）标志物。采用Western blot分析NGF/PI3K/PKCδ通路。分子对接预测Ech与Src激酶的结合。应用NGF中和抗体进行功能验证。 结果：Ech治疗显著改善UUO触发的肾组织学损伤、肾小管凋亡、炎症浸润及ECM积聚。机制上，Ech显著抑制NGF（Ngf）的过表达，抑制PI3K、AKT及Src的磷酸化，并下调UUO肾脏中Prkcd的表达。分子对接结果显示Ech与Src激酶具有高结合亲和力。此外，阻断内源性NGF可有效减轻UUO诱导的肾脏炎症及纤维化病变，证实NGF在肾纤维化进展中具有重要调控作用。 结论：Ech通过调控NGF/PI3K/PKCδ/Src信号通路改善肾脏炎症与纤维化，提示Ech可能作为肾纤维化的一种有前景的天然治疗药物。

论文解读：松果菊苷通过NGF/PI3K/PKCδ/Src信号通路减轻肾纤维化的机制研究

一、研究背景与科学问题

肾纤维化是慢性肾脏病（CKD）进展至终末期的共同病理途径，全球约10%的成年人受其影响，其中25%-40%的CKD患者会进展至纤维化阶段。糖尿病肾病（约占45%）和高血压肾损伤（约占30%）是主要病因，而我国患者基数庞大且年增长率达6.8%。未受控制的纤维化会加速肾小球滤过率（GFR）每年下降4-12 mL/min，最终需要透析或肾移植。肾纤维化的发病机制涉及四条核心通路：TGF-β1/Smad3激活驱动肌成纤维细胞转分化与胶原沉积；缺氧诱导的活性氧（ROS）通过NF-κB/MAPK信号加剧炎症；Bcl-2/Bax比例失调触发肾小管上皮细胞凋亡；M2巨噬细胞极化通过IL-10和TGF-β1分泌促进纤维化进展。目前临床主要依赖肾素-血管紧张素系统抑制剂，但仅能延缓疾病进展，亟需多靶点干预策略。

中药单体在抗纤维化领域展现出独特优势，如黄芪甲苷IV可激活Nrf2/ARE通路、降低ROS水平并促进巨噬细胞向抗纤维化M2表型极化；丹参酮IIA可显著改善肾微循环并阻断PDGF介导的成纤维细胞增殖。这些天然化合物具有高生物相容性和多靶点协同调控优势。松果菊苷（Ech）是从松果菊属和肉苁蓉等药用植物中提取的天然苯乙醇苷类化合物，具有抗氧化、抗炎和神经保护等多种药理活性。已有研究证实Ech可通过降低TNF-α、IL-1β和IL-6含量促进成骨和血管生成，并对对乙酰氨基酚诱导的肝毒性具有显著保护作用。然而，Ech在肾纤维化中的作用机制尚未完全阐明，特别是其与神经生长因子（NGF）及其下游信号通路的关系值得深入探究。近期研究表明，NGF可能通过激活PI3K/AKT和PKCδ等信号分子加剧肾脏疾病的纤维化进展，其中蛋白激酶Cδ（PKCδ）作为PI3K的关键下游效应分子，通过调控氧化应激、凋亡和上皮间质转化（EMT）参与纤维化病理过程。但NGF/PI3K/PKCδ轴在肾纤维化中的确切作用及其作为治疗靶点的潜力仍存在争议，且尚无研究报道Ech是否通过干预该通路发挥肾脏保护作用。

基于此，本研究以NGF/PI3K/PKCδ信号轴为核心研究靶点，探讨Ech对肾纤维化的改善作用及其分子机制，旨在为肾纤维化的病理机制提供新见解，并为基于天然产物的抗纤维化药物开发奠定理论基础。

二、主要技术方法

研究人员采用雄性C57BL/6小鼠（8周龄，SPF级，体重22-26 g，购自维通利华实验动物技术有限公司）建立单侧输尿管梗阻（UUO）模型，共使用32只小鼠，随机分为四组（每组8只）：假手术组（Sham）、UUO组、UUO+Ech（20 mg/kg/天）组和UUO+Ech（40 mg/kg/天）组，Ech（纯度≥98%，Sigma-Aldrich）于术后腹腔注射给药，第14天处死取材。该动物研究经上海交通大学附属第一人民医院临床中心实验动物福利与伦理委员会批准（批准号：IACUC-2024AW001），符合ARRIVE 2.0指南。主要技术方法包括：H&E染色评估肾组织学损伤；Masson染色和天狼星红染色检测胶原沉积；TUNEL染色检测肾小管细胞凋亡；RT-qPCR检测炎症因子（TNF-α、IL-1、IL-6）、EMT相关基因（Snai1、Snail2）及ECM相关基因（Vim、Col1a1、Col3a1）的mRNA表达；Western blot检测NGF、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、PKCδ、Src、p-Src蛋白表达；免疫荧光检测E-cad、Vimentin、α-SMA、Slug、F4/80、CD3、CD206、MCP-1、collagen I等蛋白表达；分子对接（AutoDock Vina 1.2.3）预测Ech与Src激酶（PDB ID: 2SRC）的结合；应用NGF中和抗体（aNGF，3.2 μg/kg）进行功能验证。

三、研究结果

1. Ech减轻UUO诱导的肾纤维化和肾小管凋亡

与Sham组相比，UUO组左肾重量/体重（LKW/BW）比值显著升高，H&E染色显示严重肾小管损伤、管腔扩张和间质炎症浸润，Masson和天狼星红染色显示广泛间质胶原沉积和纤维化病变形成。Ech治疗呈剂量依赖性改善组织病理损伤并减少胶原积聚，高剂量Ech（40 mg/kg/天）保护效果更显著。TUNEL染色显示UUO组凋亡阳性肾小管细胞数量显著增加，Ech给药剂量依赖性减少TUNEL阳性细胞数量，表明Ech抑制UUO诱导的肾小管上皮细胞凋亡。

2. Ech减轻UUO诱导的肾脏炎症

RT-PCR结果显示，UUO组TNF-α、IL-1、IL-6、Snai1、Snail2、Col1a1和Col3a1的mRNA表达较Sham组显著升高（P<0.01），Ech（20和40 mg/kg/天）治疗不同程度降低这些因子的表达。免疫荧光结果显示，UUO组E-cad表达降低（P<0.01），而Vimentin、α-SMA和Slug表达升高（P<0.01）；Ech治疗显著增加E-cad表达并降低Vimentin、α-SMA和Slug表达（P<0.01）。此外，UUO组F4/80（巨噬细胞标志物）和CD3（T细胞标志物）表达增加（P<0.01），Ech治疗显著降低其表达（P<0.01）。

3. Ech通过NGF/PI3K/PKCδ通路减轻UUO诱导的肾损伤

Western blot结果显示，UUO组NGF、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、PKCδ和p-Src/Src表达均升高，Ech（20和40 mg/kg/天）干预显著抑制这些蛋白的表达（P<0.01）。为验证NGF在UUO诱导肾损伤中的作用，研究人员在术后第1周开始给UUO小鼠腹腔注射NGF中和抗体（aNGF）持续2周。结果显示，aNGF干预降低了升高的LKW/BW比值，恢复了紊乱的肾脏结构并减轻了间质胶原沉积；TUNEL染色显示aNGF治疗减少肾小管细胞凋亡（P<0.01）；Western blot显示aNGF治疗抑制NGF、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、PKCδ和p-Src/Src的表达（P<0.01）。分子对接结果显示Ech与Src激酶具有高结合亲和力。

4. 抑制NGF减轻UUO诱导的肾脏炎症和纤维化

RT-PCR结果显示，UUO+aNGF组TNF-α、IL-1、IL-6、Snai1、Snail2、Col1a1和Col3a1的表达较UUO组显著降低（P<0.05）。免疫荧光结果显示，aNGF治疗增加E-cad表达（P<0.01），降低Vimentin、α-SMA和Slug表达（P<0.01）。aNGF治疗还显著降低F4/80和CD3的表达（P<0.01），证实阻断内源性NGF可有效减轻UUO诱导的肾脏炎症和纤维化病变。

四、结论与意义

本研究证实，松果菊苷通过调控NGF/PI3K/PKCδ/Src信号通路改善UUO诱导的肾脏炎症与纤维化。Ech治疗显著减轻肾组织学损伤、肾小管凋亡、炎症浸润和细胞外基质积聚，抑制NGF过表达及PI3K、AKT、Src磷酸化和PKCδ表达。分子对接揭示Ech与Src激酶具有高结合亲和力。NGF中和抗体实验进一步确认NGF在肾纤维化进展中的关键调控作用。这些发现表明Ech可能作为一种有前景的天然治疗药物用于肾纤维化的防治，为基于天然产物的抗纤维化药物开发提供了新的理论依据和实验基础。