恩格列净减轻糖尿病大鼠左心室重构：涉及 SIRT1/PINK1 信号通路

《Cardiology Discovery》：Empagliflozin Attenuates Left Ventricular Remodeling in Diabetic Rats: Involvement of SIRT1/PINK1 Signaling

　　

**目的：** 探讨SIRT1/PINK1信号通路在糖尿病心室重塑中的作用，并研究恩格列净对该过程的影响。

**方法：** 采用高脂饮食联合低剂量链脲佐菌素在大雄性Sprague-Dawley大鼠中诱导糖尿病。成功诱导的糖尿病大鼠分批入组，随机分为糖尿病组、低剂量恩格列净组（10 mg/kg/天）或高剂量恩格列净组（30 mg/kg/天）。第一批每组包含6只大鼠，第二批补充大鼠至最终每组样本量为8只。同年龄非糖尿病大鼠作为对照组（n = 8）。治疗8周后，通过超声心动图和侵入性血流动力学测量评估心脏结构和功能，并通过组织学检查评估心肌肥厚和纤维化。通过呼吸控制比和JC-1荧光分别评估线粒体呼吸功能和膜电位。通过Western blotting检测SIRT1、核呼吸因子1（NRF-1）和PINK1蛋白表达水平。在高糖暴露的H9c2细胞中，使用SIRT1抑制剂EX527和SIRT1特异性小干扰RNA进一步研究SIRT1信号的参与情况。

**结果：** 与对照组相比，糖尿病大鼠左房前后径、室间隔厚度、左室后壁厚度、心肌细胞横截面积和心肌纤维化均增大，舒张功能和血流动力学功能受损（所有P < 0.05）。恩格列净治疗减轻了这些结构和功能异常，但其显著效应因剂量而异。糖尿病大鼠的线粒体呼吸控制比和JC-1红/绿荧光比显著低于对照组（均P < 0.001），恩格列净治疗后显著升高（所有P < 0.05）。糖尿病心肌和高糖暴露H9c2细胞中SIRT1、NRF-1和PINK1蛋白表达水平显著低于相应对照组（所有P < 0.05）。在H9c2细胞中，EX527抑制SIRT1与恩格列净治疗后SIRT1、NRF-1和PINK1蛋白表达降低相关（所有P < 0.05）。

**结论：** 恩格列净减轻了糖尿病大鼠的左心室重塑并改善了线粒体功能，SIRT1/PINK1信号通路可能对这些有益效应有所贡献。

**临床意义**

**有何新发现？**
在糖尿病大鼠中，恩格列净减轻了左心室结构重塑和心肌纤维化，并改善了心脏功能和线粒体功能。恩格列净与糖尿病心肌和高糖刺激的H9c2细胞中SIRT1、NRF-1和PINK1蛋白表达的变化相关。SIRT1的药理学抑制和siRNA介导的敲低进一步支持了SIRT1/PINK1相关信号通路参与恩格列净作用。

**有何临床意义？**
这些发现为恩格列净在糖尿病心肌病中的心脏保护作用提供了机制洞察，并提示涉及SIRT1/PINK1的线粒体质量控制通路可能是进一步研究的目标。

**1. 引言**

糖尿病（DM）是一种常见的代谢性疾病[1–3]，可增加不良心血管事件和死亡风险。[4,5] 糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病的主要并发症，构成一种独立的心力衰竭形式。[6] 老年糖尿病患者心力衰竭的发病率（39%）高于无糖尿病者（23%），随访43个月后发生心力衰竭的相对风险为1.3。[7] DCM的发病机制复杂，糖尿病相关的心室重塑在其进展中起核心作用。糖尿病心室重塑初期以纤维化增加、左心室壁增厚和左心室舒张末压（LVEDP）升高为特征。[8] 由于DCM早期无症状，识别早期治疗选择以防止病理性重塑至关重要。异常细胞信号、线粒体功能障碍和伴随氧化应激增加的促炎状态均被认为与DCM的发生和发展有关。[9]

在这些机制中，线粒体自噬在能量代谢中起关键作用，是心脏线粒体的重要质量控制机制。SIRT1是一种高度保守的NAD+依赖性去乙酰化酶，可增强线粒体生物发生并积极调节线粒体自噬。[10] SIRT1还被认为在心血管疾病中发挥保护作用。Luo等[11]证明营养缺乏和低氧可激活SIRT1表达并促进心肌细胞自噬。此外，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是清除过多或受损线粒体的主要途径，从而维持质量控制并支持细胞存活。[12] 然而，SIRT1/PINK1通路是否以及如何参与糖尿病心室重塑的调节仍不清楚。

钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）抑制剂可防止心脏重塑[13]，并减缓心力衰竭的进展，无论在高危无症状患者还是有症状患者中均有效，且不依赖射血分数。[14,15] 大规模随机对照试验——包括EMPA-REG OUTCOME、CANVAS和DECLARE-TIMI 58——已证明SGLT2抑制剂对2型糖尿病患者的心血管获益，尤其在降低心力衰竭住院风险方面。[16–18] 临床研究还表明，SGLT2抑制剂可显著降低糖尿病心力衰竭患者的左心室质量并改善心脏功能指标，包括射血分数和舒张功能。[19,20] 从机制上讲，SGLT2抑制剂促进尿热卡排泄，产生类饥饿代谢状态，减少心脏毒性脂质积累并促进包括心脏在内的多种组织自噬。[21] 此外，SGLT2抑制剂的潜在生酮效应可能诱导自噬。[22] 然而，SGLT2抑制剂调节自噬的精确机制仍不清楚。尽管DCM中线粒体自噬的精确分子机制有待完全阐明，但已知线粒体自噬可通过清除异常线粒体、减轻氧化应激和减少心肌凋亡来改善糖尿病心脏功能。然而，过度线粒体自噬可能加重DCM心肌损伤。我们之前的工作表明，EMPA作为SGLT2抑制剂，可维持糖尿病大鼠线粒体膜电位并改变线粒体融合和分裂动力学。[23] 鉴于SIRT1和PINK1在线粒体质量控制和线粒体自噬中的已知作用，我们假设EMPA对糖尿病心室重塑的影响可能涉及SIRT1/PINK1信号相关的线粒体自噬。在本研究中，我们使用DCM大鼠模型和高糖（HG）暴露的H9c2细胞检验了该假设。

**2. 材料与方法**

**2.1. 实验动物**

8周龄成年雄性Sprague-Dawley大鼠（0.20 kg ± 0.02 kg，无特定病原体）购自北京华阜康生物科技股份有限公司（北京，中国；生产许可证号：SCXK(京)2014-0004）。大鼠饲养于标准聚碳酸酯鼠笼中，每笼2–3只，在20–22°C、相对湿度50%–60%、12小时光照/黑暗周期的环境中。大鼠到达后适应7天再进行任何实验操作。刨花作为垫料。本研究未提供额外环境丰富化，以避免对代谢参数和心脏表型等主要读出指标产生潜在的混杂影响。动物自由摄食标准实验饲料并自由饮水。实验单位为单只大鼠，每组n = 8。所有程序符合美国国家卫生研究院发布的《实验动物饲养和使用指南》，遵守ARRIVE指南[24]，并经天津医科大学实验动物管理委员会批准（批准号：TMUaMEC2019004）。

图1展示了糖尿病模型建立和EMPA治疗的实验工作流程示意图。本研究共使用40只大鼠。其中32只大鼠使用随机数表法随机分为两组：对照组（n = 8）和高脂饮食组（HFD组，n = 24）。另补充8只大鼠用于HFD亚组实验。简要地说，根据体重对大鼠编号，从随机数表中获取两位数随机数，并根据随机数排列顺序将动物分配至各组。HFD组大鼠饲喂高脂饲料（H10060；60 kcal%脂肪，20 kcal%蛋白质，20 kcal%碳水化合物；总能量密度：5.24 kcal/g；北京华阜康生物科技股份有限公司，北京，中国）4周，对照组大鼠同期饲喂标准饲料。注射前所有大鼠禁食12小时，自由饮水。HFD组大鼠随后接受单次尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）（30 mg/kg；Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国），溶于柠檬酸盐缓冲液（pH 4.5），对照组大鼠接受等体积溶剂（柠檬酸盐缓冲液）。

注射后一周，经尾静脉采血测量血糖水平。若随机血糖浓度超过16.7 mmol/L，则认为糖尿病诱导成功，符合该标准的大鼠纳入进一步研究。[25] 未达到该诊断阈值的大鼠接受第二次同等剂量的STZ注射。第二次注射后仍未达到高血糖阈值的动物被排除。糖尿病大鼠的血糖水平每周使用Optium Xceed血糖仪（Abbott Laboratories，MediSense Products，加州阿拉米达，美国）监测。

由于STZ诱导的糖尿病建立不一定成功，必要时补充额外的HFD/STZ处理大鼠以补偿模型失败和死亡。成功诱导的糖尿病大鼠分批入组，使用随机数表法随机分配至3个实验亚组，并在确认糖尿病后进入8周干预期。最终样本量设定为每组8只大鼠。简要地说，所有成功诱导的糖尿病大鼠独立编号，随机序列由不参与后续动物操作和实验操作的研究人员生成，以尽量减少潜在分配偏倚。负责给药、样本采集和结果检测的研究人员在整个实验期间对分组分配实施盲法。为进一步减少潜在混杂偏倚，在研究期间对动物房内的笼位、给药顺序以及超声心动图和功能性测量的顺序在各实验组间进行了随机化。每组8只大鼠的样本量基于我们的初步观察和已发表的糖尿病啮齿类研究[23]确定，被认为足以检测组间心脏功能和心肌分子表型的差异。采用两批入组方式以补偿糖尿病诱导过程中可能的动物损失。亚组设置如下：糖尿病组（DM组；每日经胃给予0.5%羟乙基纤维素溶剂）、糖尿病+低剂量EMPA组（低EMPA组；10 mg/kg/天经胃给予）和糖尿病+高剂量EMPA组（高EMPA组；30 mg/kg/天经胃给予）。非糖尿病（对照）组饲喂标准饲料并在8周治疗期间经胃给予等体积溶剂。EMPA由勃林格殷格翰制药有限公司（Ingelheim，德国）提供。所有治疗连续8周每日给药一次。根据已建立文献，选择EMPA剂量以考虑种间代谢差异并确保在鼠中的充分药效学疗效。[23]

**2.2. 超声心动图评估**

治疗8周后，由对分组分配实施盲法的研究人员使用配备MS-250线阵探头（13–24 MHz，Vevo 2100；VisualSonics, Inc.，加拿大安大略省多伦多市）的高分辨率小动物超声系统进行经胸超声心动图检查。麻醉诱导使用3%异氟烷，维持使用1.5%–2.0%异氟烷，随后将大鼠置于仰卧位。超声心动图检查在异氟烷吸入麻醉下进行，以维持稳定的自主呼吸和轻度麻醉状态。超声采集过程中使用恒温加热垫持续监测并将核心体温维持在37.0°C ± 0.5°C。每次测量时同时记录心率。在胸骨旁长轴切面使用二维成像测量左房前后径、左室后壁厚度、室间隔厚度、左室舒张末径和左室收缩末径，并计算连续5个心动周期的平均值。

左心室射血分数（LVEF）采用改良的Quinones方法计算。[23] LVEF和缩短分数用于评估左心室收缩功能，而心尖部二尖瓣舒张早期与舒张晚期血流速度的比值（E/A）用于评价左心室舒张功能。2.3. 血流动力学研究超声心动图检查后，大鼠需在异氟烷麻醉后充分恢复至少72小时，方可进行有创血流动力学评估。完全恢复的标准为恢复正常食物和水摄入、正常自主活动，且无痛觉或呼吸窘迫表现。进行有创血流动力学检测时，通过腹腔注射3%戊巴比妥钠（剂量30 mg/kg）对大鼠重新麻醉，以达到足够的手术深度以植入导管。手术操作和数据记录过程中，核心体温持续维持在37.0°C ± 0.5°C。在持续心电监护下进行右侧颈总动脉插管，使用Mikro-Tip压力导管（型号SPR-838，2 F；Millar Instruments，德州州休斯顿，美国）测量血流动力学参数。所有血流动力学数据采集和离线波形分析均由不知晓分组情况的 investigators 完成。导管放置后经过5分钟稳定期，待压力波形稳定后，记录心率、主动脉收缩压（SBP）、舒张压（DBP）和平均动脉压（MBP）。随后将导管经主动脉瓣推进左心室，测量左心室舒张末压（LVEDP）以及左心室压力上升和下降的最大速率（+dP/dtmax 和 ?dP/dtmax）。2.4. 样本采集与保存血流动力学检查完成后，用戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔注射）对大鼠进行深度麻醉。整个实验期间，每日监测所有大鼠的体重、活动状态、食物摄入和身体不适体征。预定义的安乐死终点包括严重体重下降（1周内≥20%）、持续嗜睡、无法进食和明显的呼吸窘迫。严格遵守标准饲养和手术操作规范以最大限度减轻疼痛和应激。在STZ诱导糖尿病建模过程中，2只大鼠意外死亡。所有死亡动物立即从笼中取出，记录于实验日志，并按照动物伦理指南通过机构标准生物安全焚化程序处理。快速摘取心脏并用冷磷酸盐缓冲液冲洗。用于组织学分析的左心室组织固定在10%甲醛中3天，脱水后石蜡包埋。一部分新鲜左心室组织立即用于线粒体分离，用于蛋白质分析的组织用液氮速冻并储存在?80°C。2.5. 组织学固定后的心室组织石蜡包埋，用切片机切成5 μm厚的切片。切片按制造商说明进行苏木精-伊红染色以评估心肌形态学变化，并进行Masson三色染色以评估心肌纤维化。在40倍物镜下观察和拍摄组织切片。每只大鼠获取3个独立的左心室组织学切片，每个切片随机截取3–4个不重叠视野，共10个随机视野。图像采集和后续定量分析均由不知晓实验分组的研究者完成。纤维化定量分析中，使用Image-Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics，加州Carpinteria，美国）对所有样本应用统一的颜色阈值设置以识别胶原阳性染色区域。该软件用于定量分析心肌细胞横截面积和心肌纤维化面积（%）。2.6. 线粒体呼吸功能和膜电位的评估心脏摘取后快速分离约100 mg左心室组织，按照先前描述的方法[23]分离线粒体。使用二喹啉酸蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific，马萨诸塞州Waltham，美国）测定线粒体蛋白浓度。线粒体呼吸功能在25°C下使用Clark型氧电极（Oroboros Instruments，奥地利因斯布鲁克）以极谱法测量。平衡一段时间后，向反应体系中加入300 μg线粒体蛋白。待线粒体耗氧稳定后，加入20 μL含0.8 mol/L苹果酸和1 mol/L谷氨酸的混合物以启动状态2呼吸。在稳定状态2呼吸建立后，通过加入20 μL 0.5 mol/L腺苷二磷酸启动状态3呼吸。当所有腺苷二磷酸磷酸化为腺苷三磷酸后，呼吸速率回到状态4。呼吸控制比值计算为状态3与状态4呼吸速率之比。线粒体膜电位使用JC-1阳离子染料（5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑碳菁碘化物，碧云天生物技术有限公司，中国上海）评估，该染料表现出依赖膜电位的线粒体积累，并伴随荧光发射峰从525 nm（绿色）到590 nm（红色）的移动。荧光使用Cary Eclipse荧光分光光度计（Varian Inc.，加州Palo Alto，美国）测量。[23] 反应体系中JC-1的最终浓度为2 μmol/L。测定在25°C下、2 mL含300 μg线粒体蛋白的呼吸培养基中进行。线粒体悬浮液与JC-1孵育10分钟以达到平衡。随后加入15 μL含0.8 mol/L苹果酸和1 mol/L谷氨酸的混合物作为呼吸底物，记录荧光发射的变化。背景扣除后，计算红色（590 nm）与绿色（525 nm）荧光强度比值以反映线粒体膜电位；比值低提示线粒体去极化。2.7. H9c2细胞培养、处理和小干扰RNA（siRNA）敲低H9c2胚胎大鼠心肌细胞系（Cellcook Biotech Co., Ltd，中国广州）培养在含1 g/L葡萄糖和10%胎牛血清的Dulbecco改良鹰基培养基（DMEM）（Gibco，马萨诸塞州Waltham，美国）中，在37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。根据供应商提供的该批次分析证书，通过物种鉴定PCR确认细胞来源为大鼠，且放行时无支原体污染。在本实验室体外培养期间，常规监测细胞形态以确认细胞身份。细胞在传代次数较低（≤5代）时使用；收货后在本实验室未进行支原体检测。在处理前，细胞在低血清培养基（含2%胎牛血清的DMEM）中孵育12小时。细胞分为6组：正常对照组（NC）、NC+白藜芦醇、高糖（HG）、HG+白藜芦醇、HG+EMPA、HG+EMPA+EX527。白藜芦醇作为SIRT1激活剂，而EX527是选择性SIRT1抑制剂。对于HG+白藜芦醇组和HG+EMPA组，细胞分别用50 μmol/L白藜芦醇（MedChemExpress，新泽西州Monmouth Junction，美国）或10 μmol/L EMPA（Santa Cruz Biotechnology，加州Santa Cruz，美国）预处理1小时，然后用33 mmol/L葡萄糖刺激36小时。NC+白藜芦醇组的细胞用50 μmol/L白藜芦醇预处理1小时，然后在正常糖浓度条件下继续培养36小时。对于HG+EMPA+EX527组，细胞用10 μmol/L EMPA预处理1小时，然后暴露于33 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L EX527（Santa Cruz Biotechnology；溶于二甲基亚砜，DMSO）中36小时。在单独的SIRT1敲低实验中，将H9c2细胞接种到6孔板中，当细胞融合度约为70%时，按照制造商说明使用Lipofectamine 3000转染试剂（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州Waltham，美国）转染SIRT1特异性siRNA或随机阴性对照siRNA（si-NC；吉玛生物，中国苏州）。简述如下：细胞以20 nmol/L的最终siRNA浓度进行转染。siRNA序列如下：SIRT1特异性siRNA正义链：5′-GAGACUGCGAUGUCAUAAUTT-3′；反义链：5′-AUUAUGACAUCGCAGUCUCTT-3′；si-NC正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。转染24小时后，转染SIRT1特异性siRNA或si-NC的细胞进一步用vehicle或10 μmol/L EMPA处理24小时，形成4个实验组：SIRT1特异性siRNA+vehicle、SIRT1特异性siRNA+EMPA、si-NC+EMPA、si-NC+vehicle。随后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞并收集用于进一步分析。SIRT1敲低效率通过定量Western blot验证。siRNA转染后未观察到明显的细胞损伤形态学证据，实验期间细胞生长保持稳定。所有siRNA相关实验均设置至少3个独立生物学重复，每个重复包含3个技术重复。2.8. Western blot分析使用RIPA裂解液（KeyGEN BioTECH，中国南京）并补充苯甲磺酰氟（KeyGEN BioTECH）从左心室组织和H9c2细胞中提取总蛋白。蛋白样品（60 μg，5–10 μL）经SDS-PAGE分离后转至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂奶封闭后，在4°C下与抗β-actin（1:5,000；Abcam，英国剑桥）、SIRT1（1:5,000；Abcam）、核呼吸因子1（NRF-1）（1:1,000；Abcam）和PINK1（1:200；Abcam）的一抗孵育过夜，然后在室温下与适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗（山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG，均为1:5,000；Abcam）轻柔振荡孵育1小时。随后用TBST洗膜3次（每次5分钟），再进行化学发光检测。免疫反应条带使用Rhea增强化学发光底物（US Everbright Inc.，中国苏州）检测。条带强度使用Image Lab软件（Bio-Rad Laboratories，加州Hercules，美国）定量，并以β-actin进行标准化。左心室组织的Western blot分析使用每组3–4只独立大鼠的样本作为独立生物学重复。对于每个生物学样本，通过重新探测同一张膜（剥离并重新孵育一抗）作为技术重复进行至少两次免疫印迹检测；每张膜获取2–3次曝光，选择条带强度最优的曝光（在线性检测范围内）用于定量分析。初步评估了β-actin作为内参的稳定性，各实验组之间β-actin表达未观察到明显的组间差异。H9c2细胞实验独立重复3–4次；在每个生物学重复内，通过膜重新探测作为技术重复进行至少两次免疫印迹检测，每张膜收集2–3次曝光，使用最优线性范围曝光进行定量。2.9. 统计分析使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布，使用Levene检验评估方差齐性。正态分布且方差齐性的连续数据以均数±标准差表示；两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析后进行Bonferroni事后两两比较。统计分析使用GraphPad Prism 6.0软件（GraphPad Software，加州San Diego，美国）完成。P<0.05被视为具有统计学显著性。所有统计评估均由不知晓分组的研究者完成。3. 结果3.1. 糖尿病模型建立和实验分组模型诱导前，对照组和高脂饮食组（HFD）之间体重（对照组：(0.52 ± 0.03) kg，HFD组：(0.53 ± 0.03) kg；t = ?0.826，P = 0.415）或血糖水平（对照组：(6.80 ± 0.51) mmol/L，HFD组：(6.61 ± 0.70) mmol/L；t = ?0.694，P = 0.493）无显著差异。在最初24只HFD/STZ处理的大鼠中，4只未达到预定义的高血糖标准，2只在糖尿病模型建立过程中死亡，留下18只成功发展为糖尿病的大鼠。这18只大鼠立即随机分配至DM组、低剂量EMPA组和高剂量EMPA组（每组n = 6），进入8周干预期。为补偿模型失败和死亡，另外8只大鼠接受相同的HFD/STZ方案。其中6只成功发展为糖尿病，随后随机分配至3个实验组（每组n = 2）。剩余2只未达到预定义的血糖标准，予以排除。成功建模后，所有纳入后续实验的糖尿病大鼠均达到预定义的高血糖标准（>16.7 mmol/L）。糖尿病大鼠的血糖水平显著高于对照组（(23.33 ± 4.14) mmol/L vs. 对照组 (6.81 ± 0.17) mmol/L，t = 11.17，P < 0.001），也证实了DM模型的成功建立。在高剂量EMPA组中，体重和血糖水平在开始治疗后约2周达到峰值，随后下降。8周干预后，EMPA治疗组的血糖水平和体重均显著低于DM组。

与糖尿病组（DM 组）相比，低剂量恩格列净组（low-EMPA）的血糖水平显著降低（(14.95 ± 2.58) mmol/L 与 (26.65 ± 4.63) mmol/L 相比，P < 0.001），体重也显著降低（(0.62 ± 0.03) kg 与 (0.67 ± 0.06) kg 相比，P = 0.018）；同样，高剂量恩格列净组（high-EMPA）的血糖水平（(12.36 ± 0.70) mmol/L，P < 0.001）和体重（(0.54 ± 0.03) kg，P < 0.001）也显著降低[图 2]。打开多媒体模式 图 2 打开多媒体模式 治疗开始后 4 个实验组（每组 n = 8）血糖水平（2A）和体重（2B）的变化。CON：对照组；DM：糖尿病；EMPA：恩格列净。

3.2. 糖尿病大鼠的心脏结构和功能改变
DM 组的收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均动脉压（MBP）和左室舒张末压（LVEDP）均显著高于对照组（均 P < 0.05）。与 DM 组相比，高剂量恩格列净组的 SBP 显著降低（P < 0.05），而两组恩格列净组与 DM 组之间的 DBP、MBP 和 LVEDP 无显著差异（均 P > 0.05）。相反，DM 组的 +dP/dtmax 和 -dP/dtmax 的绝对值均显著低于对照组（均 P < 0.05），且高剂量恩格列净组显著高于 DM 组（P < 0.05）[表 1]。

表 1 对照组、糖尿病组、低剂量恩格列净治疗组和高剂量恩格列净治疗大鼠的超声心动图和血流动力学参数。

| 参数 | 对照组 (n = 8) | DM 组 (n = 8) | 低剂量恩格列净组 (n = 8) | 高剂量恩格列净组 (n = 8) | F 值 | P 值 |
| :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- |
| FPLAD (mm)* | 3.99 ± 0.24 | 4.53 ± 0.32* | 4.28 ± 0.08? | 4.21 ± 0.04? | 7.57 | 0.001 |
| IVST (mm) | 1.54 ± 0.06 | 2.00 ± 0.11* | 1.86 ± 0.05 | 1.66 ± 0.13? | 3.78 | 0.031 |
| LVPWT (mm) | 1.55 ± 0.09 | 2.04 ± 0.11* | 1.75 ± 0.19? | 1.62 ± 0.23? | 15.53 | <0.001 |
| LVEDD (mm) | 7.37 ± 0.07 | 6.97 ± 0.14* | 7.15 ± 0.06? | 7.16 ± 0.08? | 27.51 | <0.001 |
| LVESD (mm) | 3.87 ± 0.20 | 3.52 ± 0.12* | 3.66 ± 0.06? | 3.67 ± 0.08? | 6.37 | 0.004 |
| LVEF (%) | 77.34 ± 2.39 | 79.63 ± 1.08 | 78.90 ± 0.44 | 78.76 ± 0.58 | 2.38 | 0.097 |
| FS (%) | 47.44 ± 2.28 | 49.53 ± 1.10 | 48.85 ± 0.42 | 48.72 ± 0.56 | 2.07 | 0.126 |
| E/A | 1.45 ± 0.10 | 1.07 ± 0.11* | 1.24 ± 0.16? | 1.24 ± 0.12? | 3.72 | 0.032 |
| HR (次/分) | 309.75 ± 5.66 | 312.87 ± 4.81 | 311.13 ± 5.02 | 310.46 ± 2.34 | 0.87 | 0.616 |
| SBP (mmHg) | 124.44 ± 11.04 | 141.55 ± 9.42* | 137.93 ± 6.40 | 126.43 ± 4.45? | 6.22 | 0.004 |
| DBP (mmHg) | 70.75 ± 4.18 | 108.72 ± 9.02* | 104.77 ± 6.07 | 102.48 ± 8.45 | 48.39 | <0.001 |
| MBP (mmHg) | 88.64 ± 6.07 | 119.66 ± 7.08* | 115.82 ± 5.24 | 110.50 ± 4.28 | 47.49 | <0.001 |
| LVEDP (mmHg) | 7.71 ± 1.29 | 9.67 ± 1.07* | 8.88 ± 0.61 | 8.87 ± 0.67 | 5.34 | 0.006 |
| +dP/dtmax (mmHg/s) | 4,580.77 ± 572.38 | 3,488.00 ± 277.45* | 3,995.25 ± 467.52? | 4,048.00 ± 285.32? | 10.45 | <0.001 |
| -dP/dtmax (mmHg/s) | -2,364.10 ± 233.43 | -1,438.32 ± 115.97* | -1,829.57 ± 364.35? | -1,992.20 ± 168.22? | 22.06 | <0.001 |

数据以均值 ± 标准差表示。*与对照组相比，P < 0.05。?与 DM 组相比，P < 0.05。
+dP/dtmax：左室压力最大上升率；-dP/dtmax：左室压力最大下降率；DBP：舒张压；DM：糖尿病；E/A：二尖瓣舒张早期/晚期血流速度比值；EMPA：恩格列净；FS：短轴缩短率；HR：心率；IVST：室间隔厚度；LAD：左房直径；LVEDD：左室舒张末内径；LVEDP：左室舒张末压；LVEF：左室射血分数；LVESD：左室收缩末内径；LVPWT：左室后壁厚度；MBP：平均动脉压；SBP：收缩压。

与对照组相比，DM 组的左房直径、室间隔厚度和左室后壁厚度均显著升高（均 P < 0.05）。与 DM 组相比，两组恩格列净组的左房直径和左室后壁厚度均显著降低，而室间隔厚度仅在高剂量恩格列净组显著降低（均 P < 0.05）。相反，与对照组相比，DM 组的左室舒张末内径和左室收缩末内径显著降低（均 P < 0.05）。与对照组相比，DM 组的 E/A 比值显著降低，且低剂量和高剂量恩格列净组的 E/A 比值均显著高于 DM 组（均 P < 0.05）。

苏木精 - 伊红（HE）染色显示，与对照组相比，DM 组的心肌细胞排列紊乱、细胞大小不均且细胞间隙增宽。与 DM 组相比，高剂量恩格列净组的心肌细胞排列更为规整，形态相对均匀[图 3A]。对于基于 HE 染色的心肌细胞横截面积定量，在揭盲前因组织处理或染色过程中产生的技术伪影，每组排除了 3 只动物，最终样本量为每组 n = 5。与对照组相比，DM 组的心肌细胞横截面积显著增大（P < 0.001）。与 DM 组相比，高剂量恩格列净组的心肌细胞横截面积显著降低（P < 0.01）[图 3B]。此外，马松三色染色显示，与对照组相比，DM 组存在广泛的间质纤维化[图 3A]。打开多媒体模式 图 3 打开多媒体模式 EMPA 对糖尿病大鼠左室心肌细胞肥大和心肌纤维化的影响。(A) 左室组织切片 HE 染色和马松三色染色的代表性图像。(B) 基于 HE 染色的心肌细胞横截面积定量。(C) 基于马松三色染色的纤维化面积占心肌总面积比例定量。数据以均值 ± 标准差表示（B 和 C 部分每组 n = 5–6 只大鼠；组织处理或染色过程中产生技术伪影的样本已从相应分析中排除）。*P < 0.01，?P < 0.001。CON：对照组；DM：糖尿病；EMPA：恩格列净；HE：苏木精 - 伊红；ns：无显著差异。

在马松三色纤维化面积测量中，由于切片缺陷和组织处理过程中的技术伪影，在揭盲前从对照组和高剂量恩格列净组各排除了 2 只动物，从 DM 组和低剂量恩格列净组各排除了 3 只动物。因此，马松定量分析的最终样本量为对照组和高剂量恩格列净组 n = 6，DM 组和低剂量恩格列净组 n = 5。定量分析显示，与对照组相比，DM 组的纤维化面积显著增大（P < 0.001）；与 DM 组相比，低剂量恩格列净组（P < 0.01）和高剂量恩格列净组（P < 0.001）的纤维化面积均显著降低[图 3C]。

3.3. 糖尿病大鼠心室线粒体功能
在揭盲前，对照组排除 2 只动物，DM 组、低剂量恩格列净组和高剂量恩格列净组各排除 3 只动物，原因是线粒体分离和样本制备过程中的技术伪影。最终有效样本量为对照组 n = 6，DM 组、低剂量恩格列净组和高剂量恩格列净组均为 n = 5。与对照组相比，DM 组的线粒体呼吸控制率显著降低（P < 0.001）[图 4A]。作为线粒体膜电位指标的 JC-1 红/绿荧光比值在 DM 组也显著降低（P < 0.001）。与 DM 组相比，线粒体呼吸控制率在下低剂量恩格列净组（P < 0.05）和高剂量恩格列净组（P < 0.01）显著升高[图 4A]。两组恩格列净组的 JC-1 红/绿荧光比值也均显著高于 DM 组（均 P < 0.01）[图 4B]。打开多媒体模式 图 4 打开多媒体模式 EMPA 对糖尿病大鼠线粒体呼吸控制率（A）和 JC-1 红/绿荧光比值（B）的影响（每组 n = 5–6 只大鼠；由于线粒体分离和样本制备过程中的技术伪影，部分样本被排除）。*P < 0.05，?P < 0.01，?P < 0.001。CON：对照组；DM：糖尿病；EMPA：恩格列净。

3.4. EMPA 对糖尿病心肌病（DCM）中 SIRT1/PINK1 信号通路的影响
由于部分动物的有限心肌组织无法支持所有并行的组织学、线粒体功能和分子测定，在 SIRT1 检测中每组排除了 4 只动物，在 NRF-1 和 PINK1 检测中每组排除了 5 只动物，导致 SIRT1 检测的最终样本量为每组 n = 4，NRF-1 和 PINK1 检测为每组 n = 3。与对照组相比，DM 组的 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达水平均显著降低（均 P < 0.05）。EMPA 治疗与这些蛋白表达水平升高相关，尽管显著性差异因 EMPA 剂量而异[图 5]。对于 EMPA 治疗，SIRT1 和 NRF-1 检测进行了 n = 4 次独立实验，PINK1 检测进行了 n = 3 次；对于白藜芦醇治疗，SIRT1 检测进行了 n = 4 次独立实验，NRF-1 和 PINK1 检测进行了 n = 3 次。与对照组细胞相比，高糖（HG）培养的 H9c2 细胞中 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达水平显著降低，且经 EMPA 或白藜芦醇处理后显著升高（均 P < 0.05）[图 6A–6H]。打开多媒体模式 图 5 打开多媒体模式 EMPA 对糖尿病大鼠 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达的影响。(A) 左室组织中 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 的代表性蛋白质免疫印迹图。(B–D) SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达的定量分析。数据以均值 ± 标准差表示（每组 n = 3–4 只大鼠；部分样本被排除，因为部分动物的有限心肌组织无法支持所有并行的组织学、线粒体功能和分子测定）。*P < 0.05，?P < 0.01。印迹图在与抗体杂交前已切割。CON：对照组；DM：糖尿病；EMPA：恩格列净；NRF-1：核呼吸因子 1；PINK1：PTEN 诱导激酶 1；SIRT1：沉默信息调节因子 1。

打开多媒体模式 图 6 打开多媒体模式 EMPA 和 SIRT1 调节对 H9c2 细胞中 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达的影响。(A–D) HG 培养的 H9c2 细胞经或不经过 EMPA 处理的 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达的代表性蛋白质免疫印迹图及定量分析。(E–H) 经或不经过白藜芦醇（Res）处理的 H9c2 细胞中 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达的代表性蛋白质免疫印迹图及定量分析。(I–L) 单独使用 EMPA 或联合 EX527 处理的 HG 培养的 H9c2 细胞中 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达的代表性蛋白质免疫印迹图及定量分析。(M) 转染 si-NC 或 si-SIRT1 后 SIRT1 敲低效率的蛋白质免疫印迹分析。(N–Q) 转染 si-NC 和 si-SIRT1 的细胞经或不经过 EMPA 处理的 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达的代表性蛋白质免疫印迹图及定量分析。数据来自 3–4 次独立实验。*P < 0.05，?P < 0.01，?P < 0.001。显示的是裁剪后的印迹图；膜在孵育一抗前已切割。CON：对照组；EMPA：恩格列净；HG：高糖；NRF-1：核呼吸因子 1；PINK1：PTEN 诱导激酶 1；Res：白藜芦醇；SIRT1：沉默信息调节因子 1；si-NC：阴性对照随机序列小干扰 RNA；si-SIRT1：SIRT1 特异性小干扰 RNA。

3.5. SIRT1 抑制和敲低对 EMPA 相关蛋白表达的影响
在 EX527 实验中，SIRT1 检测进行了 n = 4 次独立实验，NRF-1 和 PINK1 检测进行了 n = 3 次。在 HG 培养的 H9c2 细胞中，HG + EMPA + EX527 组的 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达水平均显著低于 HG + EMPA 组（均 P < 0.05）[图 6I–6L]。

在 SIRT1 敲低实验中，SIRT1 和 NRF-1 检测进行了 n = 4 次独立实验，PINK1 检测进行了 n = 3 次。通过蛋白质免疫印迹法验证了 SIRT1 特异性 siRNA 的敲低效率。与阴性对照 siRNA 相比，SIRT1 特异性 siRNA 使 SIRT1 蛋白表达降低了约 83%，证实了有效的 SIRT1 敲低。与阴性对照 siRNA 转染相比，SIRT1 敲低显著降低了 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 蛋白表达（均 P < 0.05）。在 SIRT1 敲低细胞中，与未接受 EMPA 治疗相比，EMPA 治疗与所有 3 种蛋白表达水平显著升高相关（均 P < 0.05）[图 6M–6Q]。

4. 讨论
本研究的主要发现是 EMPA 在糖尿病心肌病（DCM）中发挥心脏保护作用。具体而言，EMPA 治疗 (1) 通过减少心肌细胞肥大和间质纤维化来减轻左室结构重构，同时改善心脏功能，表现为 E/A 和 +dP/dtmax/-dP/dtmax 值的改善；(2) 与糖尿病心肌中 SIRT1、NRF-1 和 PINK1 表达增加相关，并伴随线粒体呼吸功能和膜电位改善；(3) 提供了支持 SIRT1/PINK1 信号通路参与 EMPA 作用的证据。

4.1. SGLT2 抑制剂的心脏保护机制
SGLT2 抑制剂是一类独特的降糖药物，具有多器官保护益处。在一项关于人心脏组织中 SGLT2 表达的研究中，Marfella 等人[19]报告称，与来自非糖尿病对照组的相应组织相比，来自糖尿病患者的心脏内膜活检（移植后 48 周获取）中心肌细胞的 SGLT2 表达显著更高（P < 0.01）。同样，在高糖（HG）条件下培养的 AC16 人心肌细胞的 SGLT2 蛋白水平显著高于暴露于正常葡萄糖的细胞（P < 0.05）。

心肌细胞中检测到SGLT2，支持了SGLT2抑制剂可能对心肌细胞内的代谢和信号通路产生直接作用的可能性。此外，糖尿病相关的代谢失调似乎能直接促进心肌SGLT2表达的上调。[19] 此外，研究表明，人类DCM的早期病理发生与心脏移植后接受糖尿病患者的JunD/PPAR-γ过表达和脂质积累有关。值得注意的是，这种表型在联合使用SGLT2抑制剂治疗后有所减轻，提示SGLT2抑制剂可能对糖尿病心脏具有直接作用。[20] 在涉及超过70,000例患者的11项大规模临床试验中，长期SGLT2抑制可使心血管死亡或心力衰竭住院的联合风险一致降低20%至25%。[26] 钠排泄、渗透性利尿、血浆容量收缩、血压降低以及动脉僵硬度减轻是SGLT2抑制剂心血管获益的潜在机制之一。2017年，一份题为"心力衰竭中mt功能作为治疗靶点"的专家共识文件[27]重点关注了能量产生不足在进展性左心室功能障碍中的作用，并建议探索能够保存和改善能量供应的治疗策略。自噬体损伤会诱导线粒体功能障碍和脂质积累，从而加重DCM；而自噬体的激活则能对抗高脂饮食诱导的DCM。[28] 我们此前已证实，糖尿病兔的心室线粒体活性氧产生速率升高、线粒体膜电位去极化以及线粒体肿胀。[29] 最近，我们报道了EMPA能减轻糖尿病大鼠的心房重构，保留去极化的心房线粒体膜电位，并改变线粒体融合和分裂蛋白水平。[23] 然而，SGLT2抑制剂对高脂饮食联合STZ诱导糖尿病大鼠的线粒体自噬的影响尚不清楚。4.2. SGLT2抑制剂减轻左心室重构 左心室重构是指在心肌损伤和/或慢性心肌负荷条件改变反应中发生的功能、结构、心肌细胞和间质变化。在低流量、低梯度主动脉狭窄患者中，心肌细胞中SGLT2基因和蛋白表达升高，并与心肌纤维化、炎症和氧化应激相关。[30] AC16人室性心肌成肌细胞在高糖暴露7天后，NF-κB和SOD2启动子区域出现显著去甲基化，导致两种基因的mRNA表达水平升高。[31] EMPA-HEART CardioLink-6随机临床试验报道，经EMPA介导的SGLT2抑制在6个月后与左心室质量指数（按体表面积校正）显著降低相关。[32] Januzzi等[33]发现，与安慰剂相比，卡格列净治疗可延缓老年2型糖尿病患者2年内血清N末端B型钠尿肽前体的升高。SGLT2抑制剂对左心室重构的减轻作用已在糖尿病和非糖尿病动物模型中均有观察。Yang等[34]报道，与未治疗的卡迪欧综合征动物相比，EMPA治疗的卡迪欧综合征动物LVEF明显保留，左心室重构被显著抑制。另一项非糖尿病心脏研究也报道了左心室收缩功能的类似改善——通过LVEF和超声心动图衍生的应变进行评估。[35] 在本研究中，我们扩展了这些发现，证明EMPA减轻了糖尿病诱导的左心室重构，包括心肌细胞肥大和间质纤维化减少，以及E/A和+dP/dtmax/-dP/dtmax值的改善，与既往发现一致。4.3. EMPA调节DCM中SIRT1/NRF-1/PINK1信号通路 异常细胞信号传导、线粒体功能障碍以及伴有氧化应激增加的促炎状态已被认为与糖尿病室性重构的发展和进展有关。[9] 在这些机制中，线粒体自噬在能量代谢中发挥关键作用，并构成心脏线粒体质量控制的必要机制。尽管线粒体自噬在DCM中的确切分子机制尚未完全阐明，但最近的发现表明，线粒体自噬主要通过清除异常线粒体来改善糖尿病心脏功能，从而防止氧化应激并减少心肌细胞凋亡。然而，过度自噬可能加重DCM患者的心肌损伤。既往研究已证实，SIRT1富集或激活可减轻氧化和内质网应激、清除功能障碍线粒体、促进线粒体生物发生、缓解细胞衰老和细胞死亡、改善纤维化和重构以及保留心脏功能。[10] Luo等[11]表明，营养缺乏和缺氧可激活室性心肌细胞中的SIRT1表达并促进自噬。NRF-1是线粒体稳态不可或缺的氧化还原决定因子，整合多层次调控网络。[36] 此外，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是清除过量或受损线粒体的主要途径，可维持线粒体质量控制并促进细胞存活。[12] 维持自噬相关信号通路是对抗心功能障碍的重要保护机制。对终末期心力衰竭人心的转录组学分析表明，线粒体信号失调是衰竭心肌的特征性标志，常伴有泛素介导的自噬通路被抑制。与健康对照相比，衰竭人心的PINK1蛋白表达显著降低，而在特发性扩张型心肌病患者中Parkin表达也下调。[37] 在本研究中，我们发现糖尿病组和高糖培养的H9c2细胞中SIRT1、NRF-1和PINK1蛋白表达水平均显著低于对照组。EMPA处理部分逆转了这些降低，而在EX527与EMPA联合治疗后，SIRT1、NRF-1和PINK1表达水平显著低于单独EMPA处理组。此外，siRNA介导的SIRT1敲低与H9c2细胞中NRF-1和PINK1蛋白表达显著降低相关。然而，在SIRT1敲低条件下，EMPA处理仍能显著增加SIRT1、NRF-1和PINK1蛋白表达，尽管其表达水平仍低于阴性对照siRNA转染细胞。值得注意的是，SIRT1特异性siRNA使SIRT1蛋白表达降低了约83%，表明敲低有效但不完全。因此，EMPA处理后SIRT1蛋白表达的增加可能反映了对残余SIRT1表达的影响。或者，EMPA可能通过转录非依赖性机制（如蛋白质稳定性改变）影响SIRT1蛋白丰度。这些可能性在本研究中未被直接探究，需进一步研究。总之，这些发现支持SIRT1/NRF-1/PINK1信号通路参与了EMPA的心脏保护作用。研究表明，EMPA通过调节酮体代谢和氧化应激改善DCM中的线粒体功能障碍。[38] 类似地，在我们此前的工作中，我们发现EMPA保留了糖尿病大鼠的心房线粒体膜电位并改变了线粒体融合和分裂蛋白水平。[23] 我们的发现支持了越来越多的证据，表明SGLT2抑制剂具有超越降糖的心脏保护效应，可能通过涉及线粒体质量控制和自噬相关信号通路的机制发挥作用。4.4. 临床转化 我们的发现为EMPA在DCM中心脏保护作用的机制提供了见解，提示SIRT1/PINK1信号通路和线粒体质量控制可能参与其有益作用。鉴于线粒体功能障碍在DCM中的核心作用，调节线粒体质量控制通路可能代表一种潜在的治疗策略。然而，本研究的发现基于动物和细胞模型，需要进一步研究以确定其临床相关性并阐明SIRT1/PINK1信号通路在DCM患者中的作用。4.5. 局限性 本研究存在若干局限性应予说明。第一，未检测血浆EMPA浓度和心肌SGLT2表达，限制了药物暴露和目标靶标激活的评估。第二，H9c2细胞不能完全重现成年心肌细胞的表现型和功能，且未评估细胞活力、凋亡和线粒体呼吸等功能性细胞结果。此外，未纳入使用甘露醇的渗透对照；因此，不能完全排除33 mmol/L高糖模型中细胞外渗透压升高产生的潜在非特异性效应。未单独纳入DMSO溶媒对照组，但最终DMSO浓度维持在0.1%（v/v）以下，该浓度据报道对H9c2细胞影响可忽略不计。第三，尽管评估了PINK1表达，但未检测自噬或线粒体自噬通量及其他经典自噬相关标志物。因此，本研究的发现支持SIRT1/PINK1相关信号通路的参与，但未直接证明线粒体自噬增强。第四，未研究EMPA对心脏功能的长期影响及其在DCM患者中的临床相关性。第五，高剂量EMPA显著降低了SBP；因此，不能完全排除血流动力学卸载对心脏重构减轻的贡献。第六，仅纳入雄性大鼠，本研究结果推广至雌性动物的可行性尚待确立。此外，高脂饮食/STZ诱导的糖尿病大鼠模型不能完全重现人类DCM，这限制了对患者直接外推这些发现。最后，由于模型诱导失败和死亡需要补充动物，糖尿病大鼠分批纳入并进入干预阶段。尽管采用相同的实验程序，但不能完全排除潜在的批次相关效应。5. 结论 EMPA减轻了DCM中的左心室重构并改善了线粒体功能，SIRT1/PINK1信号通路可能对这些有益作用有所贡献。这些发现为EMPA的作用机制提供了见解，并支持进一步研究DCM中SIRT1/PINK1信号通路。 资助 本研究由中国国家自然科学基金（82200364）、天津市卫生健康委员会中医药和中西医结合科研项目（2025057）、天津市教委科研项目（2025KJ104）和天津市重点医学学科建设项目（TJYXZDXK-3-006B）资助。 作者贡献 邵清苗、刘大祺和范海超完成了几乎所有实验，是撰写稿件的主要贡献者。周鲁和谢炳信完成了超声心动图和血流动力学研究。张志伟进行了数据分析。Gary Tse修改了稿件。张涛、王媛媛和刘彤为通讯作者，所有实验均在他们的指导下完成。所有作者阅读并批准了最终稿件。 利益冲突 无。 数据可用性 本研究期间生成和/或分析的数据集不公开，但可根据合理请求向通讯作者索取。