《Journal of Veterinary Diagnostic Investigation》：Hypervirulent Listeria isolated from a wild rabbit in Canada
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单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是李斯特菌病（listeriosis）的致病菌，该病是一种主要食源性疾病，在人群中死亡率为30%。尽管单核细胞增生李斯特菌可感染动物，但野生动物能否作为储存宿主仍研究不足，尤其是在加拿大。研究
单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是李斯特菌病（listeriosis）的致病菌，该病是一种主要食源性疾病，在人群中死亡率为30%。尽管单核细胞增生李斯特菌可感染动物，但野生动物能否作为储存宿主仍研究不足，尤其是在加拿大。研究人员对从一只提交至圭尔夫大学加拿大野生动物健康合作组织的野生棉尾兔（Sylvilagus floridanus）中分离的单核细胞增生李斯特菌株（W0463-24）进行了表征。该兔头部严重肿胀，口鼻和眼部周围有多处结痂，被诊断为播散性淋巴瘤、伴革兰阳性菌的多灶性坏死性肝炎和线虫病。肝和脾的土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）PCR为阴性，肝细菌培养单核细胞增生李斯特菌为4+。全基因组分析将分离株W0463-24鉴定为序列型1（sequence type 1，ST1）、克隆复合群1（clonal complex 1，CC1）和谱系I（lineage I）。通过计算机分析（in silico）鉴定出多个毒力和应激反应基因，包括李斯特菌致病岛3（Listeria pathogenicity island 3，LIPI-3）。体外对人结肠腺癌细胞（human colon adenocarcinoma，Caco-2）的侵袭，W0463-24显著高于野生型菌株10403S。研究发现，这一ST1、CC1、谱系I野生动物分离株具有高致病潜力，强调野生动物既可能是潜在储存宿主，也是易受单核细胞增生李斯特菌感染的种群。
研究背景与问题：单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）为革兰阳性胞内食源性病原，是李斯特菌病（listeriosis）的致病菌，可影响人和动物的易感群体；免疫抑制者、孕妇、老年人和新生儿风险较高，可发生脓毒症、自然流产和神经系统并发症。该菌可在多种宿主中呈亚临床携带，包括鸟类、啮齿类、猪、犬科、马和人；羊、牛、山羊等反刍动物为常见携带者，并可通过粪便排菌和食品污染参与传播。该菌还常从即食食品（ready-to-eat foods）中分离，对低pH、低温、高渗和氧化应激具有较强适应与持续存在能力。其毒力依赖李斯特菌致病岛（Listeria pathogenicity island，LIPI；携带毒力基因的基因组岛）；LIPI-1高度保守，LIPI-3和LIPI-4等与高毒力表型相关。LIPI-1编码prfA及plcA、plcB、hly、mpl、actA，参与吞噬体逃逸、胞内生存、肌动蛋白运动和细胞间传播。该菌分为4个谱系，谱系I与人间临床暴发相关，谱系II与食品和自然环境相关，谱系III和IV与反刍动物相关；谱系I常因LIPI-3编码李斯特菌溶血素S而致病性增强，并有助于肠道定植。CC1已在食品、动物和环境样本中检出。加拿大野生动物作为李斯特菌病基因组流行病学储存宿主的作用仍研究不足；全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）已广泛用于公共卫生和食品部门，但野生动物分离株数据有限。因此，研究人员对来自加拿大野生兔的W0463-24进行表征，以评估其基因组组成、致病潜力和进化关系。
技术方法：样本为2024年6月23日提交至Hobbitstee Wildlife Refuge的一只野生棉尾兔（Sylvilagus floridanus），因眼口周皮肤异常肿胀于6月24日安乐死，6月27日送圭尔夫大学加拿大野生动物健康合作组织尸检；肝样本作细菌培养，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF）初步鉴定为W0463-24。纯培养提取DNA后行Illumina WGS；以sigB等位基因分型确认，并进行质控、组装、注释、计算机分析多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）及核心基因组系统发育分析；以BLAST和毒力因子数据库（Virulence Factor Database，VFDB）分析毒力与应激基因；Caco-2细胞侵袭试验比较W0463-24与10403S，采用Mann–Whitney U检验，p≤0.05为显著。
研究结果：
1. 病例与分离鉴定：通过尸检和镜检，兔头部严重肿胀，口鼻和眼周多处结痂；肝脾散布无数针尖白灶，脾头附近有4–5个3–5 mm隆起白灶，肾皮质少量白灶；播散性淋巴瘤累及皮肤、脾、肝、肺、肾、淋巴结和肾上腺；肝随机坏死灶内含革兰阳性杆状菌，偶见巨噬细胞胞质内菌体；脑未见显著异常。肝灶土拉弗朗西斯菌PCR阴性；肝细菌培养获得纯培养且大量单核细胞增生李斯特菌，MALDI-TOF鉴定为W0463-24。
2. 全基因组测序与系统发育：通过WGS和sigB等位基因分型确认W0463-24为单核细胞增生李斯特菌AT 58；计算机分析MLST将其归为谱系I、ST1、CC1。基于33个李斯特菌基因组的核心基因组最大似然树显示，W0463-24与其他谱系I菌株聚集。
3. 毒力与应激存活基因：通过BLAST/VFDB分析，W0463-24具有大多数毒力基因，包括普遍存在的LIPI-1和谱系I特异的LIPI-3，后者编码溶细胞肽李斯特菌溶血素S，并含肠道定植相关ilsA、ilsB、ilsD、ilsG、ilsH、ilsP、ilsX、ilsY；基因判定标准为≥98% identity、≥90% coverage、E ≤ 1 × 10
?10。该菌还含内化素A和B以及InlF、InlP；InlF被认为可调节炎症反应以促进早期感染和脑侵袭，InlP与胎儿胎盘感染相关。研究亦分析LIPI-3、LIPI-4及应激存活岛（stress survival islet，SSI）SSI-1、SSI-2相关基因。
4. Caco-2细胞侵袭试验：通过90 min侵袭试验，以细胞内回收菌量占接种量的百分比计算侵袭效率，W0463-24对人结肠腺癌细胞（Caco-2）的侵袭显著高于标准实验室野生型菌株10403S（p < 0.001，Mann–Whitney U检验）。研究人员认为，其高毒力可能与所鉴定的CC1和谱系I相关毒力基因有关；ST1和CC1菌株与严重临床结局相关，并已在多样环境中发现。
讨论与结论：研究提供了一株兔源野生动物单核细胞增生李斯特菌具有CC1相关高毒力的证据，依据为基因组表征和体外侵袭效率增加。该兔同时被诊断为李斯特菌感染和淋巴瘤；人类中已有播散性李斯特菌感染与包括淋巴瘤在内的免疫抑制状态合并症并存的报道。一项研究描述了加拿大萨斯喀彻温省3只野兔的李斯特菌病例，但单核细胞增生李斯特菌在野生动物中的流行率和传播仍认识有限。野生动物可能作为高毒力菌株储存宿主，污染与家畜及人类食物来源共享的环境，并构成人兽共患溢出的关键环节；研究强调对单核细胞增生李斯特菌野生动物储存宿主及其栖息地进行监测的重要性。
研究结论部分翻译：研究人员提供证据表明，一株兔源野生动物单核细胞增生李斯特菌具有CC1相关高毒力，该结论由基因组表征和体外侵袭效率增加所支持。值得注意的是，该兔同时被诊断为李斯特菌感染和淋巴瘤。人类中已有播散性李斯特菌感染与包括淋巴瘤在内的免疫抑制状态合并症并存的报道。一项研究描述了加拿大萨斯喀彻温省3只野兔的李斯特菌病例；然而，对单核细胞增生李斯特菌在野生动物中的流行率和传播的认识仍有限。野生动物可能作为高毒力菌株的储存宿主，污染与家畜及人类食物来源共享的环境，并构成人兽共患溢出的关键环节。研究人员的发现强调了对单核细胞增生李斯特菌野生动物储存宿主及其栖息地进行监测的重要性。
