转录组分析揭示ASFV CN/SC/2019 pA104R-K5R感染中TNF-α/NF-κB信号通路相关宿主炎症反应增强

《Virus Research》：Transcriptomic analysis reveals enhanced host inflammatory responses associated with TNF-α/NF-κB signaling pathway during infection with the ASFV CN/SC/2019 pA104R-K5R

　　

转录组分析揭示，非洲猪瘟病毒（ASFV）CN/SC/2019 pA104R-K5R感染过程中宿主炎症反应增强与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）/核因子κB（NF-κB）信号通路相关
• 转录组分析显示，与野生型病毒相比，ASFV CN/SC/2019 pA104R-K5R突变病毒诱导独特且更强的宿主反应。
• K5R突变病毒引起广泛的宿主转录改变，其特征为炎症和免疫反应相关基因的显著上调。
• K5R毒株增强的炎症表型与TNF-α/NF-κB炎症信号及NLRP3炎症小体（NLRP3 inflammasome）增加相关。

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的严重出血性病毒病，对全球养猪业构成重大威胁，病死率可达100%；ASFV还可感染软蜱并在家猪与野生环境间持续传播，增加根除难度。ASFV为Asfarviridae科唯一成员，基因组约为170–190 kb双链DNA，编码150–200种病毒蛋白，参与复制、装配、存活及宿主互作。除复制装配功能外，ASFV蛋白可抑制或激活宿主先天免疫和炎症信号。pA104R是主要存在于成熟病毒粒子核区的组蛋白样蛋白，可结合双链和单链病毒DNA，并与ASFV拓扑异构酶II互作促进DNA超螺旋，参与病毒DNA复制、修复、重组和转录；前期研究显示宿主因子RNF2介导pA104R赖氨酸5（K5）位K48连接多泛素化并促其蛋白酶体降解，从而抑制ASFV复制，但pA104R对宿主炎症尤其K5R突变后宿主转录和炎症网络的影响尚不清楚。因此，研究人员比较ASFV CN/SC/2019 pA104R-K5R突变株与亲本ASFV CN/SC/2019株感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAMs）的转录组，并结合通路富集和分子验证，分析TNF/NF-κB相关通路及炎症小体相关反应，以理解pA104R在宿主免疫调节和ASFV致病中的可能作用。研究得出，K5R突变病毒感染与更强宿主炎症反应及TNF-α/NF-κB相关信号激活相关，提示pA104R K5位点是影响宿主-病毒互作和促进ASFV复制的关键因素，为ASFV结构蛋白双重功能及减毒疫苗靶点提供依据。

关键技术方法：研究人员使用分离自30日龄猪肺灌洗液的原代PAMs，分别感染ASFV CN/SC/2019或pA104R-K5R（感染复数，multiplicity of infection，MOI=1.0），于12、24、48 hpi收集样本；24 hpi行RNA-Seq（Illumina NovaSeq 6000），以DESeq2筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）（|log₂FC|>1且FDR<0.05）；进行基因本体（Gene Ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）、Reactome富集及STRING蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析；实时定量PCR（RT-qPCR，2^-ΔΔCT法，GAPDH内参）验证转录本；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测TNF-α和IL-1β；免疫印迹（Western blot）检测病毒蛋白及NF-κB/炎症小体相关蛋白；采用one-way ANOVA和Student’s t-test统计。

3.1 Effects of the pA104R K5R mutation on viral protein expression and sample-level transcriptomic profiles：通过PAMs感染野生型（WT）或K5R病毒及未感染对照，免疫印迹显示K5R组p30在48 hpi显著高于WT，pA104R在12、24、48 hpi均高于WT，p30和pA104R随时间增加；测序质控Q20约98%以上、Q30至少94%，GC分布一致，PCA、PCC和小提琴图显示组内重复性好、组间分离明显。结论：样本转录组数据可靠，K5R突变影响病毒蛋白表达。

3.2 Transcriptomic profiling reveals an asymmetric DEG landscape and enhanced host inflammatory and immune responses associated with pA104R-K5R：按DEG标准，WT vs NC为283上调、10481下调，K5R vs NC为877上调、7441下调，K5R vs WT为8193上调、50下调；Venn显示K5R vs WT上调基因中7128个（87%）在WT vs NC下调。热图显示WT vs NC上调基因中60%为病毒基因，K5R vs NC中仅19%；K5R vs WT上调以CCL17、CXCL8、IL-1β、TNF、CCL14、NLRP3等炎症免疫因子为主，PROS1、ACP5、MPEG1、MARCO降低。结论：K5R可能增强宿主炎症和免疫反应。

3.3 GO and KEGG enrichment analysis of DEGs reveals metabolic, autophagic, and TNF/NF-κB-associated inflammatory pathway alterations：GO显示DEGs主要定位于胞内和胞内部分；免疫炎症相关生物学过程在WT vs NC富集免疫系统过程等，K5R vs NC富集免疫系统过程、免疫反应等，K5R vs WT富集对细胞因子反应、细胞对细胞因子刺激、白细胞激活。KEGG显示WT和K5R vs NC富集HSV-1感染、代谢通路、自噬、溶酶体、NOD样受体信号；K5R vs WT显著富集内质网蛋白加工、代谢通路和TNF信号通路（ko04668），其中115个基因中80个上调；K5R vs NC的TNF通路为14上调、61下调；热图显示IL-1β、TNF-α、CCL2、TLR4、RELA参与TNF和NF-κB通路。结论：突变病毒调节宿主代谢和炎症反应。

3.4 Protein-protein interactions (PPI) network analysis of DEGs：STRING PPI显示WT vs NC中心节点为MMP9、TLR2、TLR4，K5R vs NC为CCL5、CXCL2、TLR4；K5R vs WT中更多DEG居中心，IL-1β、TNF-α、NLRP3、CCL8、MPEG1、MARCO广泛互作，主要涉及炎症反应、先天免疫和病原识别。

3.5 RT-qPCR validation of RNA-Seq data reveals inflammatory gene expression changes in the pA104R-K5R group：随机选6个上调和6个下调基因，RT-qPCR趋势与RNA-Seq一致；K5R vs WT中RELA、IL-1β、TNF-α、CCL14、NFKB2、NLRP3升高，MPEG1、MARCO、C4BPA、PROS1、ACP5、ACE降低，TNF-α和NLRP3高表达。结论：RNA-Seq可靠，K5R与增强TNF-α/NF-κB炎症信号相关。

3.6 ASFV CN/SC/2019 pA104R-K5R differentially regulates innate immune-related gene expression：热图显示STAT1、NLRP3、IL-1α、IL-10、CXCL8、IL-1β、ISG12、OAS1参与先天免疫通路；RT-qPCR显示K5R vs WT的IL-1α、IL-10、CXCL8升高，STAT1和OAS1降低；STAT1/OAS1在RNA-seq与RT-qPCR间趋势不一致，可能为转录本检测和定量方法差异。结论：K5R可能在转录水平差异调控先天免疫基因。

3.7 ASFV CN/SC/2019 pA104R-K5R enhances TNF-α/NF-κB-associated inflammatory signaling and promotes inflammatory responses：感染24 hpi，K5R组p-IκBα和p-p65高于WT，NF-κB进一步激活；NLRP3、IL-1β、ASC蛋白升高，ELISA显示炎症因子升高。结论：K5R增强TNF-α/NF-κB相关炎症信号并促进炎症反应。

讨论总结：讨论指出ASF高致死且ASFV蛋白功能研究有限；转录组分析有助于揭示ASFV蛋白功能；pA104R高度保守且其影响宿主转录程序尚未系统研究；本研究显示K5R组炎症免疫基因表达增加，通路富集于代谢、TNF和NF-κB信号，提示突变病毒与增强炎症免疫信号相关；ASFV蛋白与宿主炎症调控相关，pA104R除复制/结构功能外参与免疫调节，K5R位点改变与感染细胞炎症增强相关；WT与K5R均显著改变宿主转录谱，WT下调基因更多，提示亲本株更广泛抑制宿主转录；K5R vs WT大量上调而仅50个下调，87%的上调基因在WT vs NC中下调，另有1065个K5R特异上调基因，提示K5R改变宿主转录反应并使大量被抑制基因相对上调；RT-qPCR与RNA-seq对STAT1/OAS1不一致可能源于样本生物学变异，研究不支持I型干扰素通路统一激活，K5R可能差异调控炎症相关基因和干扰素刺激基因；TNF/NF-κB通路是核心，PPI中IL-1β、TNF、NLRP3为枢纽，突变病毒感染增加TNF-α、IL-1β、RelA转录及p65磷酸化，并增加IL-1β、NLRP3、ASC、AIM2等炎症小体相关蛋白，提示pA104R可能参与TNF/NF-κB介导炎症信号，调控失衡可导致过度炎症，对宿主免疫调节、细胞死亡和ASFV-宿主互作具意义。

研究结论翻译：本研究通过整合转录组、分子和蛋白分析，揭示ASFV pA104R在调节宿主炎症反应和先天免疫中的关键作用。与野生型病毒相比，pA104R突变病毒增强PAMs中TNF/NF-κB通路活性，与炎症细胞因子表达增加及NLRP3炎症小体相关分子激活相关。同时，STAT1、OAS1等免疫相关基因变化提示K5R突变病毒可能影响先天免疫反应。这些发现表明pA104R的K5位点是影响宿主-病毒互作和促进ASFV复制的关键因素。鉴于pA104R已知参与病毒转录、DNA复制和基因组包装，本研究进一步扩展其在免疫调节中的功能作用。该工作为关键ASFV结构蛋白在病毒复制和宿主免疫调节中的双重功能提供新见解，并为阐明ASFV-宿主互作及鉴定减毒疫苗开发潜在靶点提供重要理论支持。