基于生物安全防护病毒系统鉴定埃博拉病毒小分子抑制剂

《Virus Research》：Identification of small molecule inhibitors of Ebola virus by use of a biologically contained virus system

　　

埃博拉病毒（Ebola virus）是丝状病毒科（Filoviridae）中致病性最强的病原体之一，目前针对埃博拉病毒病（EVD）的防治手段十分有限。本研究利用一种生物安全防护的埃博拉病毒系统，在生物安全二级（BSL-2）条件下开展了抗病毒药物筛选。研究人员对一个包含2，620种推定解旋酶抑制剂的小分子化合物库进行了表型筛选，以评估其对表达肾荧光素酶（Renilla luciferase）的埃博拉ΔVP30病毒（Ebola?VP30 RenLuc virus）的抑制作用。初步筛选鉴定出36种化合物可将病毒感染率降低≥80%且细胞活力维持在≥90%；经单时间点验证，11种化合物可将病毒滴度降低超过100倍且细胞毒性较低，其中F2019-2014和F2019-2141两种化合物可完全抑制埃博拉ΔVP30病毒的复制。这11种化合物的半数抑制浓度（IC50）范围为1.6–5.6 μM，半数细胞毒性浓度（CC50）≥14.9 μM，选择性指数（SI）为3.7–47.3。初步机制研究表明，部分化合物可抑制病毒糖蛋白介导的细胞进入，部分化合物可抑制病毒RNA合成（通过微型基因组实验验证），另有部分化合物的作用机制尚待阐明。其中，F2019-2141兼具抑制病毒进入和微型基因组活性的双重作用。这些发现为抗丝状病毒药物研发提供了新的化学骨架，并为后续作用机制研究和药物优化奠定了重要基础。

论文解读

一、研究背景与意义

埃博拉病毒（Ebola virus）属于丝状病毒科（Filoviridae）正埃博拉病毒属（Orthoebolavirus），是一种非节段性负链RNA病毒，基因组约19千碱基，编码七种蛋白质：表面糖蛋白（GP）、核蛋白（NP）、病毒蛋白VP35、VP40、VP30、VP24以及RNA依赖性RNA聚合酶（L）。自1976年发现以来，埃博拉病毒已引发多次 sporadic 疫情，其中2013–2016年西非疫情最为严重，造成超过28，000人感染和11，000余人死亡。

目前针对埃博拉病毒病的防治手段十分有限。预防方面，仅ERVEBO单剂疫苗和Zabdeno/Mvabea两剂疫苗方案获批用于预防埃博拉病毒感染，且对其他属内物种无效；治疗方面，靶向埃博拉病毒糖蛋白的单克隆抗体Inmazeb和Ebanga被推荐用于治疗，但核苷类似物瑞德西韦（remdesivir）在细胞培养和非人灵长类中虽表现出强效抗埃博拉活性，却未能在人类患者中展现同等疗效。口服前药obeldesivir在非人灵长类中对埃博拉病毒、苏丹病毒和马尔堡病毒有效，但其人体疗效仍未知。这些有限的防治手段凸显了扩大治疗药物库的迫切性。

解旋酶（helicase）在许多病毒的生命周期中发挥关键作用，是抗病毒药物研发的重要靶点。丙型肝炎病毒的NS3解旋酶、SARS-CoV-2的NSP13解旋酶以及单纯疱疹病毒1型的解旋酶-引发酶均为病毒基因组复制、重塑和包装所必需。尽管埃博拉病毒缺乏经典解旋酶基序，但此前有研究报道其VP35蛋白虽无保守解旋酶基序却具有类解旋酶活性。基于这一观察，研究人员以富含解旋酶靶向小分子的化合物库作为表型筛选起点，在不预设VP35为分子靶点的前提下开展抗埃博拉药物发现研究。

二、关键技术方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：第一，利用生物学防护的埃博拉ΔVP30病毒系统（Ebola?VP30 RenLuc virus），该系统缺失VP30基因，需在稳定表达VP30的Vero VP30细胞中增殖，可在生物安全二级（BSL-2）条件下安全开展抗病毒化合物评估；第二，对Life Chemicals公司提供的2，620种注释为具有细胞或病毒解旋酶抑制活性的小分子库进行表型感染筛选，通过荧光素酶报告基因定量病毒感染率，并采用MTS法平行评估细胞活力；第三，通过空斑实验（plaque assay）验证化合物的抗病毒效力，测定半数抑制浓度（IC₅₀）和半数细胞毒性浓度（CC₅₀）；第四，采用埃博拉病毒微型基因组实验（minigenome assay）评估化合物对病毒复制/转录的影响；第五，利用表达埃博拉GP、马尔堡GP或安第斯病毒GPC的重组水泡性口炎病毒（VSV）系统评估化合物对病毒糖蛋白介导的细胞进入的抑制作用。

三、研究结果

3.1 鉴定具有抗埃博拉ΔVP30病毒活性的化合物

研究人员对2，620种注释为解旋酶抑制活性的化合物进行了基于细胞的表型筛选。其中1，837种化合物（占库的70%）在Vero VP30细胞上维持>90%的细胞活力，未显示细胞毒性。共鉴定出183种化合物（占库的7%）可将埃博拉?VP30病毒复制降低≥80%，其中36种化合物同时表现出低细胞毒性（细胞活力≥90%）。

3.2 单时间点抗病毒活性验证

从初筛结果中选取32种化合物（4种因无法单独购买而未纳入）进行验证研究。在5 μM浓度下处理Vero VP30细胞后感染埃博拉?VP30 RenLuc病毒（MOI=0.001），4天后通过空斑实验测定病毒滴度。结果显示：15种化合物仅将病毒滴度降低不到10倍；6种化合物将滴度降低10–100倍；11种化合物将滴度降低超过100倍，其中7种的降低具有统计学显著性。F2019-2014和F2019-2141两种化合物完全抑制了埃博拉?VP30 RenLuc病毒的复制。

3.3 细胞活力与抗病毒效力

对11种将病毒滴度降低超过100倍的化合物测定了IC₅₀和CC₅₀值。所有化合物的CC₅₀值≥14.9 μM，其中F2019-0043在检测浓度高达100 μM时仍未见毒性。11种化合物的IC₅₀范围为1.6–5.6 μM。完全抑制病毒复制的F2019-2014和F2019-2141表现出最佳抗病毒效力，IC₅₀分别为1.7 μM和1.9 μM。选择性指数（SI）范围为3.7–47.3。

3.4 初步作用机制研究

研究人员通过埃博拉病毒微型基因组实验评估了11种化合物对病毒复制/转录的影响。其中5种化合物对微型基因组活性影响甚微（降低3%–15%）；其余6种化合物（F3411-4809、F2019-1379、F2019-2393、F2019-2395、F2019-2075和F2019-2141）显著降低微型基因组活性，其中F2019-2141降低幅度最大（50%）。但进一步检测发现，3种化合物显著降低了由细胞启动子驱动的Renilla荧光素酶表达水平，提示部分化合物对微型基因组活性的影响可能部分反映其对细胞过程的广泛作用而非对病毒复制/转录的特异性抑制。

在病毒进入抑制实验中，研究人员使用表达埃博拉GP（VSV-Ebola GP）、马尔堡GP（VSV-Marburg GP）或安第斯病毒GPC（VSV-Andes GPC）的重组VSV感染野生型Vero细胞。结果显示：6种化合物将VSV-Ebola GP病毒滴度显著降低至少100倍。其中F2019-0789和F2019-2075特异性地抑制埃博拉GP介导的进入，对马尔堡GP和安第斯GPC介导的进入无显著抑制作用；F2019-2393、F2019-2202、F2019-2014和F2019-2141同时显著抑制埃博拉GP和马尔堡GP介导的进入，但对安第斯GPC介导的进入无抑制作用；F3411-4809完全抑制安第斯GPC介导的进入，但对埃博拉GP和马尔堡GP介导的进入无影响。

四、讨论与结论

研究人员从富含解旋酶相关活性注释的化合物库中筛选出11种能有效降低埃博拉病毒感染且细胞毒性较低的化合物，其中2种可完全抑制埃博拉ΔVP30病毒感染。由于目前尚无稳健、可重复的生化实验可直接测定埃博拉VP35的推定解旋酶活性，化合物是基于表型感染实验评估而非依据VP35酶活性抑制进行选择。研究结果表明，这些化合物可能通过不同机制发挥抗病毒作用：F2019-2141因其能完全抑制埃博拉ΔVP30病毒复制、将微型基因组活性降低50%并显著抑制埃博拉GP和马尔堡GP介导的VSV感染而备受关注，但该化合物不影响细胞启动子驱动的荧光素酶表达及安第斯GPC介导的VSV感染，提示其抗病毒活性具有一定特异性；F2019-2014表现出相似的抗病毒特征但未显著抑制微型基因组活性；F2019-2394和F2019-0043虽将病毒滴度降低至少100倍，但在VSV感染和微型基因组实验中均表现出极小的抑制活性。

本研究的重要局限性在于所鉴定化合物的分子靶点和更详细的作用机制仍有待确定。由于无法直接测定埃博拉VP35的推定解旋酶活性，研究人员无法确定在微型基因组实验中表现抑制作用的化合物是否通过直接靶向VP35的类解旋酶活性发挥作用。尽管如此，研究结果表明，从富含解旋酶相关活性注释的化合物库中筛选的化合物能有效抑制埃博拉病毒感染，为未来机制研究奠定了坚实基础。虽然这些化合物的选择性指数（SI=3.7–47.3）较为有限，需要大量药物化学优化以提高选择性和扩大治疗窗口后才能推进至体内评估，但这些初步筛选命中化合物代表了开发针对埃博拉和马尔堡病毒的广谱治疗药物的起点，有望满足丝状病毒疫情中尚未被满足的医疗需求。