《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Advances and challenges in mapping protein-nucleic acid interaction interfaces by cross-linking mass spectrometry and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry
编辑推荐：
•CLMS和HDX-MS生成蛋白质-核酸相互作用界面的正交图谱•CLMS和HDX-MS工作流中的关键实验设计考量•CLMS和HDX-MS工作流中核酸带来的挑战及解决方案•在揭示空间约束和动态构象信息方面的互补性•在蛋白质和核酸上同时定位结合位点的有前景方向引言蛋白质和核酸是生
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CLMS和HDX-MS生成蛋白质-核酸相互作用界面的正交图谱
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CLMS和HDX-MS工作流中的关键实验设计考量
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CLMS和HDX-MS工作流中核酸带来的挑战及解决方案
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在揭示空间约束和动态构象信息方面的互补性
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在蛋白质和核酸上同时定位结合位点的有前景方向
引言
蛋白质和核酸是生命所必需的两类基本生物分子。通过多种非共价相互作用，包括静电相互作用、氢键和疏水相互作用，蛋白质与核酸（DNA、RNA或两者）形成稳定的复合物，即蛋白质-核酸复合物。这些复合物在广泛的必需生物过程中发挥关键作用，如复制、转录、翻译、剪接、修复和重组。理解这些复合物中的相互作用界面是阐明其结构组织、功能机制和调控作用的关键。然而，由于蛋白质-核酸相互作用固有的多样性、动态性和结构异质性，相关研究仍然充满挑战。目前，尚不存在简便或通用的框架来指导研究人员为确定特定蛋白质-核酸复合物的相互作用界面选择合适的方法[1]。这凸显了持续推动方法学进步并采用针对性方法以应对这些复杂性的必要性。
蛋白质与核酸之间的相互作用界面可以通过传统结构生物学技术进行直接可视化，如X射线晶体学[2]、核磁共振（NMR）波谱[3]、[4]和冷冻电子显微镜（cryo-EM）[5]。然而，每种方法都有其固有局限性。核酸分子通常高度灵活且对微环境敏感，这可能导致某些复合物中蛋白质与核酸之间的结合较弱或具有动态性。这使得获得X射线晶体学所需的稳定晶体变得困难。在这种情况下，NMR是一种可行的替代方法，但其应用受到分子量（MW）的限制。许多蛋白质-核酸复合物（如核糖体和外泌体）由多个DNA/RNA和蛋白质亚基组成，往往超过了适合NMR分析的分子量范围[6]、[7]。同时，冷冻电子显微镜虽然极大地推动了大型蛋白质复合物的研究，为其结构提供了前所未有的见解，但冷冻电镜通常在一个结构中分辨率不均匀，某些区域可高分辨率解析而其他区域则定义不清。为此，低分辨率区域通常需要与互补技术结合以获得全面的结构信息[8]。因此，对蛋白质-核酸复合物的深入分析通常需要结合多种方法，以克服单一方法的局限性，从而全面理解其结构和功能特性。
近年来，质谱（MS）已成为研究蛋白质和蛋白质复合物的有力工具，与传统的生物物理方法形成互补。在这些技术中，蛋白质印记方法（如氢氘交换（HDX）、羟基自由基印记和残基特异性化学标记）受到了广泛关注[9]、[10]、[11]、[12]。这些方法通过标记蛋白质的溶剂可及区域，基于可识别的质量变化检测复合物形成前后的标记模式差异，从而为蛋白质-核酸相互作用的界面和构象变化提供有价值的见解。值得注意的是，HDX是一种破坏性最小的技术，因为它是在分析蛋白中将氢原子替换为氘原子，而不引入额外的化学基团。这一特性使HDX在研究天然蛋白质结构时具有特别优势，可以最大程度地减少结构扰动或表征伪影。另一种重要的技术——交联质谱（CLMS），通过快速连接空间上相邻的两个氨基酸残基，为探测蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种直接的方法[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。CLMS能够提供传统结构生物学方法通常无法获取的结构信息，因为它可以捕捉蛋白质在溶液中或细胞环境中发生的瞬时重排和相互作用。此外，与传统结构生物学技术相比，CLMS具有样本消耗低、对蛋白质纯度要求较低、不受蛋白质大小限制、灵敏度高和分析速度相对较快的显著优势。
由于核酸的存在，蛋白质-核酸复合物表现出更为显著的多样性、动态性和异质性特征。当研究对象从蛋白质复合物转变为蛋白质-核酸复合物时，核酸的存在需要额外的考量，如样品制备、可用工具、与现有工作流的兼容性等。在本综述中，我们聚焦于CLMS和HDX-MS在分析蛋白质-核酸相互作用界面方面的最新进展。我们还探讨了这两种技术的互补性质及其联合应用，突出了它们在更全面理解蛋白质-核酸复合物方面的潜力。
章节片段
CLMS概述
CLMS是一种研究蛋白质高级结构和蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的创新且强大的方法。CLMS利用交联剂共价连接空间上邻近的氨基酸残基，这些残基可以位于同一蛋白质内，也可以位于不同蛋白质分子之间。经过酶解消化后，使用质谱鉴定交联肽对及其交联位点对，从而有助于重建蛋白质的三维结构以及
HDX-MS概述
HDX-MS是一种强大且多功能的工具，由于HDX反应速率高[108]、[109]、[110]、[111]，不仅可用于研究蛋白质的高级结构和相互作用，还可用于研究它们的动态变化。该方法的原理是：当蛋白质暴露于氘代环境（如氘氧化合物（D2O））中时，蛋白质上的活性氢原子（如-OH、-SH和-NH基团中的氢原子）与溶剂中的氘原子发生交换。对于蛋白质-核酸相互作用，
CLMS和HDX-MS的互补性及联合应用
结构生物学领域日益依赖结合正交技术的混合方法。CLMS提供静态的、距离约束的拓扑信息，而HDX-MS报告蛋白质的动态性和溶剂可及性。两者的联合应用提供了比单一技术更为全面的蛋白质结构和相互作用视图。
总结与展望
作为强大且互补的工具，CLMS和HDX-MS为生物分子复合物的结构、动态性和机制提供了独特的见解，为基础研究和治疗发现带来了新的机遇。它们的联合应用提供了蛋白质-核酸复合物的全景视图，这是单一技术无法实现的。利用质谱研究蛋白质-核酸相互作用的方法通常分为两类：识别核酸上的蛋白质结合位点以及
CRediT作者贡献声明
Jianhua Wang：撰写——初稿，调查研究，资金获取，概念构思。Yanyi Huang：撰写——审阅与编辑，资金获取，概念构思。Guanbo Wang：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，调查研究，资金获取，概念构思
利益冲突声明
? 作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知经济利益或个人关系。
致谢
本研究获得了以下基金的资助：国家自然科学基金委员会（NSFC 22504007和22474005）、中国博士后科学基金（2023M730351）、中华人民共和国科技部（2024YFA1306200和2025YFA1309300），以及新基石科学家基金会。
Jian-Hua Wang|Yanyi Huang|Guanbo Wang
