从临床病毒特异性T细胞产品中恢复巨细胞病毒反应性TCR用于制备定义的TCR-T细胞产品

《Transplantation and Cellular Therapy》：Recovery of a CMV-Reactive TCR from a Clinical Virus-Specific T-Cell Product for Generation of a Defined TCR-T Cell Product

　　

结构化摘要 背景 病毒特异性T细胞（virus-specific T-cell, VST）疗法用于异基因造血干细胞移植（allogeneic HSCT）后病毒并发症的管理。当前的VST产品是多克隆且异质性的，这限制了标准化、效力评估和精确的产品表征。基于T细胞受体（T-cell receptor, TCR）的工程化技术可能允许从供体来源的免疫中捕获抗病毒特异性，并将其重定向至更明确的细胞治疗候选产品中。 目标 从一个已输注给患者的供体来源VST产品中鉴定出一个功能性巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）反应性TCR，生成并表征一个明确的抗CMV TCR-T细胞候选产品，并评估TRAC基因敲除作为支持未来同种异体应用中内源性TCR去除的策略。 研究设计 一项针对腺病毒、BK多瘤病毒和CMV的三价供体来源VST产品，在同情用药下被输注给一名患有移植后病毒血症的儿童单倍体相合HSCT受者。利用系列输注后血液样本评估外周T细胞受体库随时间的变化。该临床VST产品用人白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）-A02:01限制性CMV pp65495–503表位进行再刺激。抗原反应性CD8+4-1BB+培养物用于功能性TCR恢复。选定的CMV反应性TCR经小鼠恒定区重建，克隆至MSGV1 γ-逆转录病毒载体，并导入原代人T细胞。对工程化细胞进行了导入TCR表达、抗原特异性激活、干扰素-γ（interferon-gamma, IFNγ）分泌、HLA-A02:01限制性识别、内源性TCR随时间表达变化以及生成TRAC破坏的TCR-T细胞群体的评估。 结果 序贯VST输注后的外周TCR库分析显示，显性循环TCRβ克隆型发生时间性变化，其注释基于与临床VST产品生成的抗原反应性CD4+和CD8+参考数据集的比对。用pp65495–503对VST产品进行功能性再刺激富集了抗原反应性CD8+4-1BB+细胞。从这些培养物中恢复了一个CMV反应性TCR，并根据可重复的肽特异性活性将其推进。在重建和逆转录病毒转移后，选定的TCR在原代T细胞中介导了pp65495–503特异性激活和IFNγ分泌。用pp65495–503刺激诱导了35.82%的CD3+OX40+4-1BB+细胞和约9.8 × 103 pg/mL的IFNγ，而对非关联腺病毒Hexon刺激的反应仍然很低。工程化的抗CMV TCR-T细胞对pp65495–503表现出比亲本VST产品更强的IFNγ反应。无关TCR对照组保持在基线水平附近。单独TCR转导后，内源性TCR表达早期下降，但在约第14天恢复，并持续至第35天。在CRISPR/Cas9介导的TRAC敲除后，分选前约70%的细胞处于预期的mTCR+hTCR-群体中，该群体通过流式分选得以富集用于下游表征。 结论 本研究展示了一个从供体来源VST产品中衍生定义抗病毒TCR-T细胞候选产品的临床可行工作流程。研究人员从临床VST产品中恢复了一个功能性CMV反应性TCR，并将其重定向至原代T细胞，同时保留了pp65特异性活性。单独转导后内源性TCR表达的恢复表明，早期的下调不足以持久去除天然TCR。因此，整合TRAC敲除提供了一种策略，用于生成更明确的工程化T细胞群体，以推动未来抗病毒细胞疗法的发展。

研究背景与目的

病毒再激活和新发病毒感染是同种异体造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT）后发病和死亡的主要原因。供体来源的病毒特异性T细胞（virus-specific T cells, VST）疗法已被用于恢复移植后的抗病毒细胞免疫，但现有VST产品本质上是多克隆和异质性的，其抗原特异性、效力和显性克隆型在不同供体、产品和临床情境间存在差异，这限制了产品的标准化、效力评估和精确表征。基于T细胞受体（T cell receptor, TCR）的工程化技术能够从供体来源的免疫中捕获特定的抗病毒特异性，从而有望开发出更明确的细胞治疗产品。此外，对TRAC基因座进行基因组编辑以消除内源性αβ-TCR表达，可能有助于减少内源性TCR介导的识别并改善产品定义。本研究旨在从一个已临床应用的供体来源三价VST产品中恢复功能性CMV反应性TCR，生成并评估一种定义明确的抗CMV TCR-T细胞概念验证产品，并评估TRAC破坏作为去除内源性TCR的策略。

研究方法

研究人员从一个已输注给患有移植后病毒血症的儿童单倍体相合HSCT受者的供体来源三价VST产品（靶向腺病毒、BK多瘤病毒和CMV）出发。通过抗原再刺激实验从该临床VST产品中恢复CMV反应性TCR，并进行功能筛选和验证。随后，将选定的CMV反应性TCR序列进行小鼠恒定区重建，构建至MSGV1 γ-逆转录病毒载体，并转导至原代人T细胞。通过CRISPR/Cas9介导的TRAC基因座破坏来去除内源性TCR表达，并通过流式分选富集mTCR⁺hTCR^-的工程化细胞群体。采用共培养实验、流式细胞术和IFNγ酶联免疫吸附试验（ELISA）评估工程化细胞的抗原特异性激活、HLA限制性识别和功能效力，并与亲本VST产品进行比较。

研究结果

1. 临床使用供体来源的三价VST产品于儿科单倍体HSCT受者

一名携带生殖系UNG1突变的联合免疫缺陷8岁女性患儿接受了单倍体相合HSCT。移植后出现高滴度腺病毒血症和CMV再激活。研究人员在同情用药下给予患者来自单倍体相合供体的三价VST产品（靶向腺病毒、BK多瘤病毒和CMV）。患者共接受5次输注，每次1×10⁵细胞/kg。首次输注后出现1级急性皮肤移植物抗宿主病（GvHD），经局部类固醇治疗后缓解。后续输注未观察到额外不良事件。病毒载量监测显示治疗后下降，随访期间保持低水平。需注意，VST产品主要用于治疗腺病毒血症，而CMV再激活则同时接受了系统性更昔洛韦治疗。

2. 序贯VST输注后的外周TCR库动态变化

通过对输注后系列外周血样本进行批量TCR测序，发现尽管重复输注同一批次的冷冻保存VST产品，显性循环TCRβ克隆型仍随时间发生变化。研究人员通过将外周血克隆型与临床VST产品生成的CD4⁺或CD8⁺ pp65反应性参考数据集进行序列比对注释，揭示了输注后T细胞库的动态行为，并为将输注后外周血克隆型与VST产品内的抗原反应性群体联系起来提供了框架。

3. 从临床VST产品中功能性恢复并验证一个CMV反应性TCR

研究人员用最小CMV pp65^495–503表位再刺激临床VST产品，通过活化标志物上调鉴定出抗原反应性CD8⁺4-1BB⁺细胞。TCR选择基于功能性抗原识别而非外周血中的克隆丰度。经重建和转导至原代人T细胞后，该TCR在代表性验证实验中，约78%的CD4⁺T细胞和41%的CD8⁺T细胞表达了导入受体（由小鼠TCR恒定区mTCR染色检测）。共培养实验显示，用pp65^495–503刺激后，诱导了35.82%的CD3⁺OX40⁺4-1BB⁺细胞和约9.8×10³ pg/mL的IFNγ分泌，而对非关联腺病毒Hexon肽库的刺激反应很低（1.12%和约29 pg/mL）。使用HLA-A02:01阳性第三方供体的抗原提呈细胞进行的实验进一步支持了该TCR的HLA-A02:01限制性、肽依赖性识别。

4. TCR转导后的内源性TCR下调是短暂的

在TCR转导后，即使未进行TRAC破坏，也观察到内源性人TCR（hTCR）表面表达的早期降低。然而，通过在mTCR⁺群体中量化内源性hTCR表达，研究人员发现这种下调并非持久性的。在代表性实验中，CMV TCR转导的CD8⁺T细胞在第7天显示内源性hTCR表达降低，但在约第14天恢复，并在第35天仍可检测到。使用两种不同的转基因TCR和不同受体T细胞组合的实验均观察到类似的动力学模式，表明这是TCR转导的一个普遍效应，并为使用TRAC破坏而非依赖转导相关的hTCR下调提供了依据。

5. 工程化抗CMV TCR-T细胞展现出比亲本VST产品更强的pp65特异性功能

研究人员将CRISPR/Cas9介导的TRAC破坏整合入工程化流程。分选前，约70%的细胞处于预期的mTCR⁺hTCR^-群体中，随后通过流式分选富集。TRAC破坏后，细胞对CD3/CD28磁珠刺激的IFNγ分泌显著降低，证实了内源性TCR/CD3复合体介导的信号减弱。在抗原特异性功能评估中，分选的mTCR⁺hTCR^-抗CMV TCR-T细胞在与HLA-A*02:01阳性抗原提呈细胞及pp65^495–503或pp65肽库共培养时，展现出比亲本VST产品更强的IFNγ分泌，而无关TCR转导的对照组保持在基线水平。这表明从临床VST产品恢复的CMV反应性TCR可用于生成一个定义明确的抗CMV TCR-T群体，其在体外展现出优于原始多克隆VST产品的pp65特异性功能。

总结与讨论

本研究成功建立了一个从临床应用的供体来源VST产品中衍生定义明确的抗病毒TCR-T细胞候选产品的功能性工作流程。研究人员恢复了一个功能性CMV反应性TCR，并将其成功重建和转移到原代人T细胞中，保留了pp65特异性活性。研究还发现，TCR转导后的内源性TCR下调是短暂的，不能持久去除天然TCR，这强调了整合TRAC破坏策略的必要性。通过结合TCR转移和TRAC破坏，研究人员生成了一个缺乏可检测内源性TCR表达的工程化T细胞群体，并且该群体保留了增强的pp65特异性功能。

研究结论指出：本研究展示了一个从供体来源VST产品中衍生定义抗病毒TCR-T细胞候选产品的临床可行工作流程。研究人员从临床VST产品中恢复了一个功能性CMV反应性TCR，并将其重定向至原代T细胞，同时保留了pp65特异性活性。单独转导后内源性TCR表达的恢复表明，早期的下调不足以持久去除天然TCR。因此，整合TRAC敲除提供了一种策略，用于生成更明确的工程化T细胞群体，以推动未来抗病毒细胞疗法的发展。这项工作为超越CMV，将该策略应用于其他临床相关病毒靶点提供了框架，并为开发受体定义的抗病毒T细胞疗法奠定了基础。