葛根素高亲和力 DNA 适配体的筛选及其在荧光传感中的应用

《Talanta》：Selection of a high-affinity DNA aptamer for puerarin and its application in fluorescence sensing

　　通过文库固定的捕获-SELEX技术筛选出了一种新型葛根素结合DNA适配体。ThT荧光和MST检测显示Pue-1对葛根素具有纳摩尔级亲和力。突变和选择性研究证实了Pue-1对葛根素的识别依赖于序列且具有优先性。基于链置换的适配体传感器在稀释葛根提取物中的检测限达到29.5 nM。## 引言中医药（TCM）源于中国和亚洲其他国家长期的临床实践，至今仍是药物和保健产品的重要来源[1]。随着中医药在疾病预防和治疗中的广泛应用，严格的质量控制对于确保中医药产品的安全性、有效性和一致性变得越来越重要[2], [3]。葛根素（Pue）是大叶葛的特征性异黄酮类化合物，被广泛用于评价该药材的质量[4]。除了其在药材标准化中的作用外，葛根素因具有心血管保护、抗炎、神经保护和抗氧化活性而备受关注[5], [6], [7], [8]。因此，可靠的葛根素检测不仅与药品质量评估相关，也与生物利用度、代谢和药代动力学研究密切相关。目前已开发出多种葛根素的分析方法。色谱技术因其灵敏度和可靠性而最为成熟[9], [10]，但通常需要昂贵的仪器、繁复的样品制备和受过训练的操作人员。这些要求限制了其在快速分析和常规筛查中的应用。电化学测定法[11]、免疫测定法[12]和分子印迹技术[13]也已被研究。然而，复杂的制备工艺、不够理想的选择性或复杂基质中有限的稳定性可能限制了其实际应用[14]。因此，仍然需要能够简单、快速且选择性地检测葛根素的替代识别策略。适配体是通过序列依赖的折叠和分子相互作用来识别靶标的短单链核酸。它们通过系统进化配体指数富集（SELEX）技术在体外产生，相比抗体具有诸多优势，包括生产成本经济、化学稳定性高、可重复合成和方便进行化学修饰[15], [16], [17], [18], [19]。这些特性推动了基于适配体的生物传感器的发展，用于多种靶标的检测，包括金属离子、小分子、蛋白质和全细胞[20], [21], [22], [23], [24]。黄酮类化合物，尤其是槲皮素，已知能与G-四链体（G4）结构相互作用，包括人类端粒序列、与癌基因相关的G4基序以及SARS-CoV-2 RNA G4[25], [26]。这一特性促使研究人员利用能形成G4的DNA作为黄酮类化合物分析的平台。例如，c-MYC G4序列Pu24T已被用于儿茶素和葛根素的识别[27], [28]。然而，此类基于G4的序列通常对结构相似黄酮类化合物的区分能力有限，且对葛根素的亲和力较弱，据报道结合常数仅为88.8 μM[29]。因此，需要专门的选择来获得更适合灵敏且选择性检测葛根素的识别元件。在本研究中，我们采用文库固定的捕获-SELEX筛选出了一种针对葛根素的DNA适配体。筛选所得序列Pue-1呈现预测的茎环结构，以纳摩尔级亲和力结合葛根素，并且与所测试的相關黄酮类化合物相互作用显著减弱。随后，我们将Pue-1整合到一种链置换的发光型适配体传感器中，并评估其在稀释葛根提取物中的响应。本研究提供了一种新的葛根素识别元件，为基于适配体的天然产物小分子分析提供了实用基础。### 捕获-SELEX按照已报道的方案并稍作修改进行捕获-SELEX实验[30]。含有30个核苷酸随机区域（N30）的DNA文库通过与生物素化的捕获链杂交而固定在链霉亲和素琼脂糖树脂上。用选择缓冲液（10 mM PBS，pH 7.4，补充2 mM MgCl?）去除未结合的序列。然后将用相同缓冲液配制的葛根素引入，以释放经历了靶标依赖性解离的序列### DNA适配体的筛选葛根素的化学结构见图1A。以葛根素为靶标通过捕获-SELEX筛选出DNA适配体。起始文库含有30个核苷酸随机区域（N30），并通过与生物素化的捕获链杂交而固定在链霉亲和素琼脂糖珠上（图S1）[34]。N30区域两侧为引物结合序列，可形成碱基配对茎，该设计旨在支持适配体折叠和靶标诱导的释放。在每一轮中，### 结论在本研究中，通过13轮文库固定的捕获-SELEX筛选出了一种结合葛根素的DNA适配体。筛选所得适配体Pue-1在ThT荧光测定中的表观Kd为738 nM，MST检测中Kd为111 nM。突变体和无关序列对照实验证实，所观察到的识别依赖于Pue-1的特异性序列和结构组织，而其对Hes和Que相互作用显著减弱，则支持其对葛根素的优先结合。Pue-1**曾林曲：** 原稿撰写、可视化、方法学、调查、形式化分析、数据整理。**邹莉：** 审阅与编辑、监督、项目管理、经费获取、概念构思。## 利益冲突声明作者声明，不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。## 致谢本工作受国家自然科学基金（编号：81903570）、广东省基础与应用基础研究基金（编号：2021A1515011519）以及广东省第二中医院琶洲学者项目（编号：PZXZ2025-008）资助。