《Talanta》：Cascade DNA walker-driven photo-controlled CRISPR/Cas12a nanorobot enabling ultrasensitive one-pot detection of dual miRNAs in triple-negative breast cancer
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•该级联DNA walker整合了催化发夹组装（CHA）与酶介导的链置换反应。•开发了一种光开关型CRISPR/Cas12a纳米机器人。•该方法通过一锅操作实现了超低灵敏度检测，检测限（LOD）低至50 aM。•该方法在临床血浆样本中表现出较高的三阴性乳腺癌（TNBC）诊断准
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该级联DNA walker整合了催化发夹组装（CHA）与酶介导的链置换反应。
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开发了一种光开关型CRISPR/Cas12a纳米机器人。
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该方法通过一锅操作实现了超低灵敏度检测，检测限（LOD）低至50 aM。
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该方法在临床血浆样本中表现出较高的三阴性乳腺癌（TNBC）诊断准确率（AUC = 0.964）。
引言
微小RNA（miRNAs）是一类调控基因表达的小分子非编码RNA，影响着多种细胞功能和生理过程[1]、[2]。miRNA水平的异常已被证实与多种疾病的发病及进展相关，尤其是癌症[3]、[4]。例如，miRNA-21和miRNA-155已广泛应用于三阴性乳腺癌（TNBC）的研究中，而TNBC是一种侵袭性强且由于缺乏成熟的预测性生物标志物而带来显著诊断挑战的亚型[5]、[6]。传统的miRNA检测方法包括Northern印迹、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、基因芯片和下一代测序（NGS）[7]、[8]、[9]、[10]。RT-qPCR作为定量分析的"金标准"，具有较高灵敏度，但缺乏多重检测能力，且在提取过程中可能损失miRNA。基因芯片可实现高通量筛选，但对低丰度miRNA的灵敏度较低。NGS有助于新靶标的发现，但成本高、流程复杂；而Northern印迹则耗时费力且灵敏度低。这些缺点限制了它们在研究和临床实践中的广泛应用。这也凸显了开发低成本、简便且超低灵敏度的方法来同步评估多种miRNA的重要性。
CRISPR/Cas12a（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白12a）系统已成为分子检测与诊断中的有力工具[11]、[12]。然而，大多数基于CRISPR/Cas12a的检测技术一次仅能分析一种靶标[13]、[14]、[15]。这一局限性源于Cas12a对报告链的非特异性切割，导致无法为对应靶标产生特异性信号[16]。目前，多重CRISPR/Cas12a检测策略主要分为两类。第一类是使用多个Cas12a系统或构建空间独立的阵列[17]、[18]、[19]。尽管有效，但这些策略需要复杂的设计、较高的成本以及耗时的流程，限制了其实际应用。第二种方法则利用"与"逻辑门，通过单个Cas12a系统同步检测多种miRNA，提供了更具成本效益且简便的解决方案[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。然而，这些策略中的大多数需要两步反应，从而增加了反应时间和交叉污染的风险。此外，检测灵敏度仍需进一步提高，以满足低丰度miRNA分析的需求。
DNA walker是一类可编程的DNA分子机器，能够沿着预设轨道进行自主、渐进的运动[27]、[28]。它们拥有内生的信号放大能力，源于反复行走所引起的信号累积，为生物传感应用提供了显著优势[29]、[30]。恒定活性Cas12a纳米机器人也已有报道，其在增强反式切割活性和提高检测灵敏度方面表现突出[31]、[32]、[33]、[34]。然而，单独的Cas12a纳米机器人对于低丰度miRNA的分析仍缺乏足够的灵敏度。因此，将DNA walker与Cas12a纳米机器人相结合，有望通过融合两种系统各自的独特放大优势，进一步提升检测灵敏度。为实现基于Cas12a的一锅法核酸检测，已开发出多种策略，包括通过拆分激活剂的末端延伸实现可编程空间位阻[35]、基于蔗糖浓度梯度的动态水性多相反应系统[36]，以及在均相溶液中的光活化[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。在这些方法中，光活化因其独特的时空可控性尤为吸引人。它可以避免Cas12a的过早激活及由此产生的背景干扰，同时简化一锅法反应流程。因此，开发光控Cas12a纳米机器人可为miRNA检测提供高效、一锅法且超低灵敏度的平台。
在此，我们提出了一种由级联DNA walker驱动的光控CRISPR/Cas12a纳米机器人系统，以克服上述局限，实现对三阴性乳腺癌相关miRNA的一锅法、超低灵敏度、多重检测。在miRNA-21和miRNA-155存在时，这两种miRNA同步置换引物链，触发与相邻发夹的催化发夹组装（CHA），形成具有黏性末端的双链。在聚合酶和核酸酶的辅助下，聚合—链置换反应产生大量单链DNA，进而结合到Cas12a纳米机器人上。光照激活Cas12a活性，产生强烈的荧光信号。该平台实现了检测限低至48.7 aM的一锅法超低灵敏度miRNA检测，并有效区分三阴性乳腺癌患者（AUC = 0.964）。它作为TNBC诊断中多种miRNA同步分析工具具有巨大潜力。
章节摘要
材料
人正常血清购自索莱宝科技有限公司（中国北京）。RNAsimple总RNA提取试剂盒购自天根生物科技有限公司（中国北京）。来自Lachnospiraceae细菌ND2006的LbaCas12a、NEBuffer 2.1、Nt.BsmAI（货号R0121S）及Klenow片段（3' → 5′ exo-，货号M0212MVIAL）均由新英格兰生物学实验室有限公司（中国北京）提供。dNTP混合物及HPLC纯化的寡核苷酸由生工生物科技股份有限公司（中国上海）提供。该
传感策略的流程与反应机理
所开发传感策略的流程如图1所示。简言之，从受试者采集血浆样本，随后进行总RNA提取。接着利用所构建的平台以一锅法形式检测两种靶标miRNA，并依据所产生的荧光信号强度将受试者分为TNBC组或非TNBC组。
具体检测机理阐述如下。MiRNA-21和miRNA-155介导引物链从……的置换
结论
总之，我们成功开发了一种由级联DNA walker驱动的光控CRISPR/Cas12a纳米机器人，用于对TNBC两项关键生物标志物——miRNA-21和miRNA-155——的超低灵敏度同步检测。通过将CHA与酶介导的链置换整合到级联DNA walker中，并结合光开关型CRISPR/Cas12a调控，该平台实现了超低灵敏度检测（LOD = 48.7 aM，线性范围为100 aM至1 pM）。血清回收实验与细胞系验证
CRediT作者贡献声明
余路虎：初稿撰写、资源提供、经费获取、研究构思。李晓雨：软件、方法论、调查研究。黄黎明：可视化、验证、形式化分析。
利益冲突声明
作者声明不存在可能对本研究报道工作产生影响的已知竞争性经济利益或个人关系。
余路虎|李晓雨|黄黎明
