《Talanta》：A rapid field-deployable transgenic event detection system in genetically modified (GM) cotton using annealing curve based multiplex real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
编辑推荐：
•开发了多重实时环介导等温扩增（LAMP）技术，用于棉花事件的快速现场检测。•这些检测方法对各自转基因事件的检测限为 0.1%。•基于差异退火曲线区分 LAMP 产物。•为了田间应用，结合了一种使用氢氧化钠（NaOH）的现场 DNA 提取方案。•根据转基因生物法规，该方法可全
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开发了多重实时环介导等温扩增（LAMP）技术，用于棉花事件的快速现场检测。
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这些检测方法对各自转基因事件的检测限为 0.1%。
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基于差异退火曲线区分 LAMP 产物。
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为了田间应用，结合了一种使用氢氧化钠（NaOH）的现场 DNA 提取方案。
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根据转基因生物法规，该方法可全球应用于转基因棉花事件检测。
引言
Gossypium hirsutum L.（又称美洲棉或陆地棉），约占全球棉花种植总面积的 90%。作为一种重要的纤维和种子油商品，它在温带和热带地区都有广泛种植 [1]。棉花产量受到虫害的严重影响，一般包括棉铃虫（如斜纹夜蛾Helicoverpa armigera、烟芽夜蛾Earias vittella、棉铃象甲Pectinophora gossypiella）以及刺吸式害虫，如棉蚜（Aphis gossypii）、棉叶蝉（Amrasca biguttula）和烟粉虱（Bemesia tabaci）[2]。转基因技术已成功应用于应对棉花虫害。主要的转基因棉花事件包括用于抗虫的 MON15985 (Bollgard?II)、MON531 (Bollgard?I) 和 COT102 事件，以及用于耐除草剂的 MON1445 (Roundup? Ready cotton) 和 MON88913 (Roundup? Ready Flex)。转基因棉花中也进行了性状聚合，例如 MON15985 提供多种抗虫性，以及 MON15985xMON88913 (Bt Roundup? Ready Flex) 中附加的耐除草剂性状，还有 MON15985xCOT102 ((Bollgard?III) 和 MON15985xMON88913xCOT102 (Bollgard?III Roundup? Ready Flex}。转基因棉花在全球范围内的广泛采用显著提高了作物产量并减少了农药使用。然而，为了遵守转基因生物（GMO）法规，检查未经授权的转基因事件，以及进行种子鉴定、贸易合规和各自国家的释放后监测，对可靠转基因事件检测方法的 需求增加了。
印度是最大的转基因棉花种植国，Bt 棉花种植面积约为 1120 万公顷，主要是表达 Cry1Ac 和 Cry2Ab2 蛋白的 MON15985 叠加事件以及表达 Cry1Ac 蛋白的 MON531 事件 [3]。Bt 棉花占该国棉花种植面积的 95% 以上 [2]。Bt 棉花事件，即携带cry1Ac基因的 Event1 和携带融合cry1Ab-Ac基因的 GFM-Cry1A 也已获得批准。然而，如携带vip3A基因的 COT102 事件、携带vip3A、cry1Ac 和cry2Ab2基因用于抗虫的 Bollgard?III 事件，以及包括含有cp4-epsps基因的 MON1445、MON88913 等耐除草剂事件，在该国尚未获得监管批准，尽管这些事件在其他国家已获批准。
出于监管目的，在特定国家内，需要严格监测进口货物、农民田地或供应链中未批准转基因事件的非法存在，同时还需对已批准的转基因事件进行种子鉴定。因此，需要通过快速方法定期监测有意或无意引入的未批准转基因棉花事件，以便在边境检查站、农民田地或紧急情况下进行现场检查。转基因序列的定性转基因检测可以在 DNA 或蛋白质水平上进行，以满足这一目的。基于 DNA 的方法，如实时聚合酶链反应（PCR），由于 DNA 的稳定性以及检测方法的特异性、灵敏度和稳健性，是全球公认的转基因检测方法 [4]。如今，数字滴液 PCR 也被广泛用于此目的 [5], [6], [7]。尽管实时 PCR 和数字滴液 PCR 被接受用于转基因检测和定量，但这些检测所涉及的仪器和复杂程序可能会限制其现场适用性 [8]。
等温核酸扩增方法，如环介导等温扩增（LAMP），由于其简单性和快速性，可以作为现场应用的技术解决方案 [9]。LAMP 被认为是一种用户友好的分子诊断工具，其中扩增可通过浊度、颜色变化或荧光进行检测 [8], [10], [11]。在这里，扩增可以在便携式系统中进行，例如干浴或 Genie?II（一种等温实时设备），作为热循环仪的替代品。在 LAMP 方法中，可以通过孵育 LAMP 反应混合物（模板 DNA、4-6 个特异性设计以识别靶 DNA 上六个不同区域的引物以及链置换Bst DNA 聚合酶），在恒定温度下通过单步检测转基因目标。内部引物对启动 LAMP 反应，该反应在恒定温度下进行，然后外部引物对使位移链进行 DNA 合成引物 [9]。此外，可以包括环引物以提高 LAMP 检测的速度和特异性 [12]。据报道，使用 Genie?II 的单目标实时 LAMP 检测已应用于多种转基因筛查目标，如花椰菜花叶病毒（CaMV）35S 启动子（P-35S*)、细茎藜花叶病毒启动子（P-FMV*)、aadA、nptII 和uidA, pat, pmi 标记基因，以及cry1Ac、cry2Ab2 和cp4-epsps 转基因 [13], [14], [15]。如果转基因筛查测试呈阳性，通常需要进行事件特异性检测以完整表征该事件。目前仅有少数关于使用 LAMP 检测棉花和玉米单事件报道。已报道用于检测转基因棉花事件 MON531、MON15985、MON88701、MON88913、COT102 的终点视觉 LAMP [16]。已开发出用于检测转基因玉米事件 - Bt11、Bt176、DAS-59122-7、MON810、MON863、T25 和 TC1507；转基因马铃薯事件 - EH92-527-1 的视觉 LAMP 检测方法 [17], [18], [19]。
实时 LAMP 中的多重化能够在一个反应中同时扩增多个靶序列，从而显著降低成本、缩短周转时间并扩大检测能力。然而，开发多重 LAMP 检测方法需要彻底优化和严格验证。在反应中包含多组引物会增加引物二聚体或非特异性产物形成的可能性，特别是在实时监测平台上。实时 LAMP 通过退火曲线分析促进多重化，允许根据其特征退火温度区分扩增产物。相比之下，视觉 LAMP 平台在多重应用方面受到限制，因为不能仅通过颜色变化来区分多个转基因目标。目前仅有一份关于使用 Genie? II 进行多重实时 LAMP 并在转基因检测中适用的报道，其靶向三个转基因筛查元素，p35S-cry1Ac、P-FMV 和nptII [8]。然而，迄今为止，尚无关于使用 Genie?II 进行多重实时 LAMP 用于事件特异性转基因检测的报道。
我们在此报道了一种多重实时 LAMP 检测方法的开发，用于同时检测 MON531 和 MON15985 Bt 棉花事件以及存在于耐除草剂转基因棉花事件（如 MON88913、MON1445 或其叠加事件如 Roundup? Ready Flex）中的cp4-epsps 基因。在针对两个Bt 棉花事件的事件特异性 LAMP 中，添加cp4-epsps 基因以提供一种完整的监管方法，用于检测印度批准的两种主要Bt 棉花事件以及未批准的耐除草剂转基因事件，如 MON88913、MON1445 及其叠加事件。在多重 LAMP 中，更高层次的多重化，如 4 重，可能会导致引物干扰，而且引物选择完全取决于差异退火温度谱。因此，还开发了另一套用于检测 MON88913 和 COT102 事件的多重实时 LAMP。据我们所知，这是第一份关于使用 Genie?II 进行多重实时 LAMP 用于转基因棉花事件特异性检测的报道，这可以被视为快速现场检测的前沿技术。在这里，我们将开发的多重 LAMP 检测方法 与一种快速 DNA 提取方案相结合，从而促进快速现场应用。示意图工作流程已在图 1 中总结。这可用于识别印度及其他国家根据各自监管要求识别棉花种子批中的授权和未授权转基因事件。
章节摘要
试剂、化学品和参考材料
为了方法开发和验证，使用了商业化Bt 棉花事件的种子，即马哈拉施特拉州杂交种子有限公司（Mahyco）的 MON531 (MON-00531-6) 和 MON15985 (MON-15985-7)，以及非转基因对照品，J. K. Agri Genetics Limited 的 Event1 (JKCH-1947 Bt) 和 Global Transgenes Limited (Nath Seeds) 的 GFM-Cry1A (GTL-GFM311-7)。其他棉花转基因事件的 DNA 样品，MON15985xMON88913 (MON-15985-7xMON-88913-8)，MON15985xMON88913xCOT102
多重 LAMP 检测方法的优化
Bt 棉花事件 MON531 携带cry1Ac 基因（编码来自苏云金芽孢杆菌（Bt）的晶体蛋白δ-内毒素），赋予对鳞翅目昆虫的抗性，包括棉铃虫、烟芽夜蛾和棉铃象甲。叠加的Bt 棉花事件 MON15985 包含cry1Ac 和cry2Ab2 基因，编码苏云金芽孢杆菌枯草亚种晶体蛋白，赋予对一系列鳞翅目害虫的抗性。Event COT102 包含vip3A 基因，编码苏云金芽孢杆菌营养期
结论
出于各国监管目的，需要针对已批准和未批准的转基因事件进行现场检测的快速方法，用于田间和入境检查站的检查。我们在此报道了一种检测限为 0.1% 的快速多重实时 LAMP 方法，结合了两步 DNA 提取方案，用于现场检测印度批准的Bt 棉花事件 MON531、MON15985 以及存在于未批准转基因事件（如 MON1445、MON88913 及其
CRediT 作者贡献声明
Monika Singh：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，验证，监督，方法论，资金获取，形式化分析，数据管理，概念化。Kushaldeep Kaur：可视化，方法论，调查，形式化分析。Divyaditya Awasthi：验证，方法论，调查，形式化分析。Shruti Sinha：验证，形式化分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文报告的工作。
致谢
作者感谢印度农业研究委员会、印度政府农业研究与教育部（DARE）以及生物技术研究与发展理事会（DBT）（根据 DBT 拨款编号 BT/PR64298/BSA/33/956/2025）的资助。作者感谢 ICAR 作物科学副总干事兼 ICAR-国家植物遗传资源局局长 D. K. Yadava 博士以及基因组资源部主任 Rakesh Singh 博士提供必要设施。我们
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