一种用于快速评估PPO抑制剂诱导氧化毒性的H?O?响应型荧光探针

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A H 2O 2-Responsive Fluorescent Probe for Rapid Assessment of PPO Inhibitor-induced Oxidative Toxicity

　　

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  开发了一种氧化应激响应型荧光探针（YPR），用于毒性评估。
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  YPR能够实现PPO抑制剂诱导的氧化应激的快速可视化。
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  在细胞和小鱼中的氧化应激成像实现了早期毒性评估。
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  YPR为除草剂安全筛选和风险评估提供了一个快速平台。

引言

杂草导致主要作物产量损失34%，对全球粮食安全构成严重威胁。[1]、[2]除草剂仍然是杂草管理中最为有效的工具之一；[3]然而，某些除草剂的使用过量或不规范可能导致环境污染以及对非靶标生物的毒性作用。值得注意的是，一些除草剂作用于植物和动物共有的保守靶标。[4][5]因此，靶标选择性不足可能导致田间施用的除草剂进入水生生态系统，并对鱼类生理产生不利影响，最终破坏生态平衡。[6]、[7]这些担忧凸显了开发新方法评估非靶标物种（尤其是鱼类）毒性的迫切需求。

原卟啉原氧化酶（PPO，EC 1.3.3.4）是叶绿素和血红素生物合成途径中最后一个共有酶，催化原卟啉原IX氧化为原卟啉IX。[8]在体内抑制PPO活性会导致原卟啉原IX在细胞质中积累，随后自发氧化为光敏剂原卟啉IX。[9]在光照条件下，原卟啉IX可产生大量活性氧（ROS），导致脂质过氧化、膜损伤和细胞快速死亡。[10]、[11]由于这种独特的ROS放大机制，PPO已成为除草剂研发的重要靶标，PPO抑制剂通常会在处理1-2天内诱导快速的白化症状。然而，PPO抑制在人类或鱼类体内也会引起类似的ROS介导的损伤，这凸显了开发选择性靶向植物的PPO抑制剂的必要性。迄今为止，已有约30种PPO抑制剂实现商业化。[1]、[12]其快速的灭杀作用虽然在农业上具有优势，但也引发了对水生生物潜在毒性的担忧。

三氟苯胺草是一种于2020年实现商业化的PPO抑制剂型除草剂，用于多种作物体系中的杂草防除。[13]、[14]2021年，食品安全中心与生物多样性中心提起了一项诉讼，声称三氟苯胺草可能对某些鱼类物种构成严重风险，并要求停止其销售。[15]这一争议加剧了对除草剂毒性早期评估的担忧。因此，迫切需要快速可靠的方法来评估PPO抑制剂的毒性，以便在研发早期识别高毒性候选物，从而提高研发效率和环境安全性。[16]

近年来化学生物学领域取得的进展表明，小分子荧光探针的合理分子工程为可视化动态生物过程提供了强大方法。[17]、[18]、[19]通过整合选择性识别基团、化学响应连接子和可调荧光团骨架，基于反应的荧光探针可以将特定分子转化转化为高灵敏度和高时空分辨率的放大光信号。[20]、[21]、[22]在这些策略中，基于磺酰基的响应基团因其裂解反应可被特定活性物种触发，并通过去除荧光淬灭基团而实现荧光恢复，而被广泛用作通用的识别和激活元件。[23]、[24]与此同时，基于分子内电荷转移（ICT）的荧光调控代表了一种成熟的构建可激活探针的策略，即通过调节荧光团骨架内的给电子或吸电子性质，改变激发态电荷分布，从而控制荧光发射。[25]这些合理设计原则使得开发化学工程传感平台以监测氧化应激相关生物过程成为可能。

在此，我们报道了一种通过监测细胞内ROS（即H₂O₂）水平来快速评估PPO抑制剂毒性的荧光成像策略。我们开发了一种新型荧光探针，命名为杨PPO ROS（YPR），采用荧光素作为荧光团，并引入五氟苯磺酰基作为氧化响应识别基团。YPR对H₂O₂具有高灵敏度和高选择性，并在570  nm处表现出显著的荧光开启响应。重要的是，该探针在生物条件下可维持稳定可靠的荧光输出，能够在细胞和小鱼中对H₂O₂进行可视化和定量分析。YPR能够灵敏响应PPO抑制剂诱导的氧化应激波动，从而实现对其对小鱼毒性的比较评估。值得注意的是，使用YPR获得的荧光成像结果与小鱼毒性试验结果高度一致，证明该探针在筛选具有潜在水生毒性的PPO抑制剂方面具有实用性。总之，YPR提供了一个高效的实时监测PPO抑制剂诱导氧化应激的平台，并为除草剂化合物的早期安全评估和环境风险评估提供了一种实用方法。

章节摘要

YPR的合成

将化合物1（300  mg，0.73  mmol）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，89  mg，0.73  mmol）、Et₃N（155  mg，1.53  mmol）和CH₂Cl₂（15  mL）的溶液在室温下搅拌15  min。然后，将化合物2（195  mg，0.73  mmol）加入烧瓶中，溶液在室温下搅拌24  h。反应完成后（通过TLC检测），向烧瓶中加入20  mL H₂O；分离有机层，水层用CH₂Cl₂（20  mL）萃取。合并有机层

探针设计与合成

荧光素衍生物因其结构可调节和优异的光物理性质，被广泛用于荧光探针开发。[35]、[36]、[37]我们选择茚满并蒽（化合物1）作为荧光团，因其具有良好的生物相容性、高荧光量子产率和良好的光稳定性。刚性的茚满并蒽结构延长了π共轭并增强了分子内电子离域，导致荧光响应红移和

结论

总之，我们开发了一种H?O?响应型荧光探针YPR，作为监测氧化应激和评估PPO抑制剂型除草剂毒性的可视化平台。YPR实现了在细胞和生物体模型中氧化应激相关反应的实时可视化，揭示了不同PPO抑制剂诱导的不同氧化应激特征。基于YPR的荧光响应与小鱼急性毒性结果之间的强相关性表明

CRediT作者贡献声明

王大为：撰写——审阅与编辑，监督，获取资金。杨广福：监督。李子璇：形式分析。黄俊杰：数据管理。周思美：形式分析。肖涵：撰写——审阅与编辑。陈丽君：数据管理。付艺璇：撰写——审阅与编辑，数据管理。郭伍英征：撰写——初稿。李敏：撰写——初稿，项目管理，调查研究，形式分析，数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们不存在任何可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（No. 22577036）、湖北省教育厅科学技术计划项目（No. 2024CSA063）以及中央高校基本科研业务费专项资金（No. CCNU24JCPT029, 2026CXGR035）的资助。

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