引言
癌症是全球范围内非传染性疾病死亡的第二大原因。由于人口老龄化和癌症风险因素的普遍存在，癌症的全球疾病负担持续上升，这已成为一个核心的公共卫生挑战[1], [2]。大多数癌症起病隐匿，患者往往在中晚期才被诊断，从而错过最佳治疗干预窗口。因此，准确的早期诊断对提高患者生存率、降低不必要的医疗成本具有重要意义[3], [4]。目前临床早期癌症诊断技术主要依赖影像学检查、血清肿瘤标志物检测和组织活检。然而，常规影像学和血清标志物检测存在灵敏度不足、假阳性率高的问题；组织活检属于侵入性操作，可能导致出血、感染等并发症，此外，采样偏差也容易产生假阴性结果[5], [6], [7], [8]。当前常规方法难以满足超早期筛查的需求。因此，迫切需要开发高灵敏度、高准确度的检测方法，为癌症早期诊断提供新工具。
近年来，随着分子成像技术的发展，其在癌症早期诊断中的优势逐渐显现。早期癌症通常伴随分子水平的异常，分子成像能够在组织形态发生变化之前识别这些改变，实现癌症早期预警[9], [10]。与传统方法相比，分子成像具有更高的诊断准确率、更优的灵敏度和优异的特异性。此外，分子成像技术还具有无创、可定位病灶等多项优势[9], [11], [12]。迄今为止，已开发出众多基于分子成像的高效检测方法。例如，Bai等人提出了一种近红外荧光传感器，可用于肿瘤标志物上皮细胞黏附分子的高灵敏、高特异检测与成像[13]。Zhai等人开发了一种靶向microRNA-21（一种在早期结直肠癌中高表达的生物标志物）的比率型发光纳米探针，可通过无创直肠给药实现肠道原位成像[14]。这些新工具为癌症早期诊断提供了新方向。然而，它们仍存在若干局限性：例如，多数仅限于动物实验研究，缺乏有效安全性保障；此外，由于多数方法仅检测单一生物标志物，因此假阳性率较高[15], [16], [17]。因此，迫切需要开发性能优异、生物相容性好、准确度高的新型检测方法。
次氯酸（HClO）是生物体内重要的活性氧物种，在先天免疫系统中充当杀菌剂。然而，其异常积累引起的氧化应激可损伤核酸、蛋白质和脂质，与多种疾病相关[18], [19], [20], [21], [22], [23]。研究表明，癌细胞中HClO水平通常较高，使其成为癌症的特征标志物。因此，可利用胞内HClO水平的差异区分癌细胞与正常细胞[24], [25], [26], [27]。无嘌呤/无嘧啶位点内切核酸酶1（APE1）是细胞核内碱基切除修复途径中的关键酶，负责从DNA中切除无嘌呤/无嘧啶位点（AP位点），在维持基因组稳定性方面发挥关键作用[28], [29]。值得注意的是，APE1在多种恶性肿瘤中异常高表达，并呈现由细胞核向细胞质转移的明显趋势，与肿瘤增殖、侵袭、转移以及放疗和化疗抵抗密切相关，是具有重要临床潜力的肿瘤诊断生物标志物[30], [31], [32], [33], [34]。HClO和APE1与肿瘤的相关性，为通过二者联合检测实现精确的癌症早期诊断提供了理论基础。因此，本研究旨在开发一种策略，通过联合使用这两种分子精确识别癌细胞。需要指出的是，选择HClO和APE1并不意味着二者之间存在直接调控关系，而是基于以下考虑：首先，癌细胞通常表现出氧化应激水平升高以及DNA损伤与修复活性增强。作为关键响应分子，HClO和APE1可分别提供与氧化应激和DNA损伤应答相关的互补生化信息。同时识别这两种与癌症相关的生化特征，比仅识别其中一项能为癌细胞识别提供更严格的判据。据此，本研究选择HClO和APE1作为AND门传感系统的两个分子输入，该系统仅在两种输入同时存在时才会激活输出信号。
核酸探针技术具有优异的序列可编程性、高靶标识别特异性、可控功能性和良好的生物相容性，在生化分析中展现出显著优势和应用潜力[35], [36]。众多检测策略被提出并应用于多种靶标分析，包括核酸、蛋白酶、功能蛋白和小分子[37], [38]。同时，许多无酶等温信号放大策略被开发用于提高检测灵敏度和稳定性，包括杂交链式反应、趾介导的链置换（TMSD）和催化发夹组装[39], [40]。在这些方法中，TMSD是一种通过碱基互补配对和分支迁移实现动态链交换的核酸调控技术。与其他两种策略相比，TMSD具有以下优势：背景低、信噪比更好；反应动力学更快且具有可编程性，响应效率高；以及稳定性优异、抗干扰能力强。这些特征使其非常适合在复杂生物环境中进行检测，赋予其广阔的应用前景[41], [42], [43], [44]。
在此，本研究基于TMSD信号放大开发了一种针对HClO和APE1的高灵敏、高特异、高效的AND门双响应荧光传感器（DRFS），用于癌细胞的特异性识别。该传感器采用两条发夹DNA（HP和TB），分别修饰磷硫代酯（PS）修饰位点和AP位点，实现对HClO和APE1的特异性识别。在两种靶标同时存在时，两条发夹被切割释放活性序列。与此同时，传感器的另一组成部分——由三条单链DNA组装而成的双链复合物（命名为NT）——被活性序列驱动启动TMSD循环，释放出一条末端标记有6-羧基荧光素（FAM）基团的短序列TC。这导致系统荧光显著增强。可依据荧光强度的变化分析靶标。值得注意的是，该方法实现了HClO低至4.69 nM、APE1低至0.06 U/mL的检测限。该方法表现出优异的抗干扰能力，在血清样品中保持可靠的检测性能。最显著的是，它成功应用于胞内成像，实现了癌细胞与正常细胞的精确区分。这凸显了其在癌症早期诊断领域的巨大前景。
