NLRP3炎症小体在间充质干细胞介导的高糖诱导睾丸支持细胞损伤修复中的作用研究

《Reproductive Toxicology》：Study on the role of NLRP3 inflammasome in MSC-mediated repair of high-glucose-induced damage to testicular Sertoli cells

　　

摘要

背景

尽管对干细胞移植修复糖尿病并发症的疗效进行了广泛研究，但尚未实现稳定修复。本研究旨在调查抑制 NLRP3 炎症小体的骨髓间充质干细胞（BMSCsLV-shNLRP3）是否表现出增强修复体外高糖诱导的睾丸支持细胞损伤的能力。

方法

从 Sprague-Dawley 大鼠中分离出 BMSCs 和睾丸支持细胞。BMSCs 被 shNLRP3 慢病毒（LV-shNLRP3）感染以下调 NLRP3 表达。睾丸支持细胞暴露于高糖中建立体外损伤模型，然后与不同组的 BMSCs 共培养。检测相关蛋白质和基因的表达、细胞分泌物以及线粒体膜电位（MMP），以评估 NLRP3 下调后 BMSCs 的修复效果是否改善。

结果

在高糖条件下，睾丸支持细胞功能显著受损，其特征是雄激素结合蛋白（ABP）和抑制素 B 分泌减少以及 MMP 降低。BMSC 干预部分恢复了受损睾丸支持细胞的功能，且 BMSCsLV-shNLRP3 表现出更强的修复效果，提高了 BMSCs 的治疗和修复潜力。

结论

下调 BMSCs 中的 NLRP3 表达增强了它们修复高糖诱导的睾丸支持细胞损伤的能力，为治疗糖尿病引起的男性生育能力受损提供了新途径。

引言

糖尿病（DM）是一种器官特异性自身免疫疾病，也是一种病因多样的慢性炎症代谢障碍。它经常与并发症相关，如动脉粥样硬化、糖尿病心肌病、糖尿病肾病和生殖系统损伤。约 35–50% 的糖尿病患者出现不同程度的生殖功能障碍，糖尿病患者生殖系统损伤的概率是非糖尿病患者的 1.9–4 倍 [1], [2]。在男性患者中，糖尿病与睾丸损伤密切相关，包括曲细精管上皮退化、支持细胞空泡变性、生殖细胞丢失和血睾屏障破坏 [3], [4]。糖尿病诱导的氧化应激是睾丸损伤和精子发生受损的主要贡献因素 [5]。这些结构变化伴随着支持细胞功能受损，如雄激素结合蛋白（ABP）和抑制素 B 分泌减少，以及线粒体膜电位（MMP）降低，所有这些都导致精子发生受损和男性不育 [6], [7], [8]。尽管某些天然化合物显示出对糖尿病睾丸损伤的保护作用 [9]，但目前糖尿病相关生殖功能障碍的治疗主要包括血糖控制和对症治疗，这些方法不能完全恢复睾丸功能，针对支持细胞损伤的有效疗法仍然有限 [10], [11]。因此，探索糖尿病相关生殖系统损伤的新治疗方法，并深入分析所涉及的病理生理机制，对于提高此类患者的生活质量至关重要。

炎症小体是一类由细胞质蛋白质组成的多蛋白复合物，能识别来自外部病原体和宿主细胞的危险信号 [12]。已鉴定出各种炎症体，其中含吡环结构域的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3（NLRP3）是最广泛研究和最具特征性的多聚体蛋白复合物之一 [13]。NLRP3 炎症体的激活不仅调节和执行炎症反应，还与多种慢性炎症疾病密切相关，包括糖尿病及其并发症 [14], [15]。除了在先天免疫系统细胞中主要表达外，炎症体也表达在其他类型的细胞中，如内皮细胞、上皮细胞和间充质干细胞（MSCs），后者是具有自我更新和多向分化能力的多能细胞 [16], [17]。在 MSCs 中，骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）被较早鉴定出来并得到了更深入的研究 [17]。

抑制 MSCs 中 NLRP3 炎症小体的表达可以有效减少组织损伤和炎症反应，减少炎症细胞因子的过度释放，促进 MSCs 的存活和功能，从而增强 MSCs 在疾病中的修复效果 [18], [19], [20], [21]。例如，Pham 等人通过下调这些细胞中 NLRP3 炎症小体的表达，提高了 MSCs 的存活和功能，并增强了其对结肠炎的治疗效果 [18]。尽管基于 MSCs 的治疗在糖尿病睾丸损伤中显示出有益效果 [22], [23], [24]，但通过干扰 NLRP3 炎症小体表达来增强 MSCs 治疗效果这一策略尚未在糖尿病相关生殖系统损伤中得到证实。

基于这些发现，我们假设高糖诱导的支持细胞损伤可以通过 BMSC 移植部分逆转，并且抑制 BMSCs 中的 NLRP3 将通过旁分泌谱从促炎表型向再生表型转变来进一步增强其修复能力。本研究旨在评估下调 NLRP3 的 BMSCs 在高糖诱导的睾丸支持细胞损伤中的修复作用，使用 ABP、抑制素 B 和 MMP 作为功能指标。

部分摘录

主要仪器和试剂材料

10 只 SPF 级雄性 Sprague-Dawley (SD) 大鼠（18–20 天龄，体重 100–150 克）由宁夏医科大学实验动物中心提供。所有动物程序均经宁夏医科大学实验动物伦理委员会批准（批准号：2024-N058）。大肠杆菌 Stbl3 菌株购自北京全金生物科技有限公司。NLRP3 shRNA 质粒购自上海 Sangon 生物工程有限公司。引物合成和质粒

BMSCs 的表征

原代 BMSCs 为贴壁、多边形或梭形细胞，大小不一，细胞核大，居中或聚集不均匀分布（图 1A-a）。第三代（P3）BMSCs 的形态更为均匀，大多数呈梭形并平行或涡旋状排列（图 1A-b）。分别使用油红 O 和茜素红染色确认了 BMSCs 的成脂（图 1B-a）和成骨（图 1B-b）能力。使用流式细胞术鉴定表面标志物

讨论

在本研究中，我们发现高糖显著损害了支持细胞功能，表现为 ABP 表达降低、抑制素 B 分泌减少和线粒体膜电位丧失。与 BMSCs 共培养部分恢复了这些功能，且 NLRP3 下调的 BMSCs 表现出更强的修复效果。这些结果表明，抑制 BMSCs 中的 NLRP3 可能增强其针对高糖诱导的睾丸支持细胞损伤的治疗潜力。

结论

本研究证明，高糖显著损害了睾丸支持细胞的分泌功能和线粒体膜电位，而 BMSC 干预部分恢复了这些功能。BMSCs 中 NLRP3 的下调进一步增强了它们的修复效果，表明抑制 BMSCs 中 NLRP3 的表达可能对糖尿病相关睾丸损伤具有治疗潜力，并可能代表一种治疗糖尿病引起的男性

CRediT 作者贡献声明

宋慧：写作 - 审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取，形式分析，概念化。曹婷婷：写作 - 原始草稿，可视化，方法学，调查，形式分析，数据管理，概念化。李辉：监督，资源，项目管理，数据管理。孔斌：监督，资源，项目管理，数据管理。许宇：监督，调查，形式分析，数据管理。杨浩浩

利益冲突声明

作者声明他们不存在任何已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

我们要衷心感谢宋慧博士在本研究实验设计阶段提供的宝贵建议和技术支持。他在研究和实验方面的专业知识对于优化我们的实验条件起到了重要作用。

我们还感谢宁夏医科大学中心实验室的工作人员在样品制备和数据采集方面提供的协助。他们的敬业精神和专业主义极大地促进了这项工作的进展。

曹婷婷 | 杨浩浩 | 许宇 | 孔斌 | 李辉 | 宋慧

宁夏医科大学