葛根素经JAK2/STAT3依赖性氧化应激–自噬轴维持小胶质细胞稳态并减轻急性脑缺血再灌注损伤

《Phytomedicine》：Puerarin preserves microglial homeostasis and protects against acute cerebral ischemia-reperfusion injury by regulating autophagy and oxidative stress through Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3

　　

葛根素（Puerarin, Pue）通过小胶质细胞重编程保护缺血性脑损伤；Pue维持稳态小胶质细胞并阻止缺血诱导的状态转换；Pue介导的神经保护需要抑制Janus激酶2/信号转导及转录激活因子3（Jak2/Stat3）；Pue抑制活性氧（reactive oxygen species, ROS）驱动的自噬并恢复小胶质细胞线粒体完整性；经Pue处理的小胶质细胞通过Jak2/Stat3依赖性信号传导提供神经元保护。

Guanfeng Xu等围绕葛根素（Puerarin, PUE）在急性脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia/reperfusion injury, CIRI）中的小胶质细胞机制开展研究，论文发表于《Phytomedicine》。研究背景在于，缺血性卒中（ischemic stroke, IS）占卒中大多数，溶栓和取栓恢复血流的同时会引发CIRI，限制神经功能恢复；其中活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量生成是早期关键事件，可导致线粒体功能障碍、氧化还原失衡、炎症激活及多种程序性细胞死亡。小胶质细胞是中枢神经系统最早响应缺血的免疫细胞，缺血后迅速发生代谢和功能重编程，释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6等促炎介质，放大神经元损伤和血脑屏障破坏。生理状态下基础自噬通过清除受损线粒体和氧化蛋白维持细胞稳态，但缺血时持续氧化应激可诱导过度或失调自噬，进一步损害线粒体质量控制并加重ROS生成，形成自我放大的致病循环。既往PUE研究多聚焦全脑或神经元反应，其细胞特异性靶点不清，是否直接调控小胶质细胞稳态、协调氧化应激与过度自噬尚未阐明；Janus激酶2/信号转导及转录激活因子3（JAK2/STAT3）虽与微胶质激活、炎症和自噬相关，但是否驱动微胶质氧化应激–自噬耦合并介导PUE保护仍未知。为此，研究人员联合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、数据非依赖采集蛋白质组学（data-independent acquisition, DIA proteomics）、药理学干预、腺相关病毒血清型9（adeno-associated virus serotype 9, AAV9）介导的JAK2敲低及体内外模型，确定PUE是否通过JAK2/STAT3依赖性氧化应激–自噬轴维持小胶质细胞稳态并减轻急性CIRI，并探讨微胶质–神经元通讯。研究结论是PUE抑制JAK2/STAT3信号，维持稳态小胶质细胞（homeostatic microglia），抑制过度自噬和氧化应激，最终保护神经元完整性；其意义在于揭示以小胶质细胞为中心的作用机制，并将JAK2/STAT3提示为缺血性卒中早期干预的潜在靶点。
研究采用短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）大鼠模型（雄性Sprague-Dawley大鼠，250–300 g，来源于浙江中医药大学），结合BV2小胶质细胞与HT22神经元氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）模型；关键技术包括scRNA-seq、DIA蛋白质组学、AAV9介导的JAK2敲低、JAK2/STAT3药理学调控、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色、苏木精-伊红（H&E）染色、透射电子显微镜（TEM）、免疫荧光（IF）、蛋白印迹（WB）、实时定量PCR（qPCR）、ROS与自噬探针检测及Transwell小胶质细胞–神经元共培养。
研究结果如下。
1. 葛根素通过抑制过度自噬和氧化应激减轻急性CIRI：在tMCAO大鼠中，PUE降低梗死体积、改善神经组织病理，TEM显示减少自噬体并保护线粒体，WB显示降低ATG3、ATG5、ATG12，且恢复谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值和超氧化物歧化酶（SOD）活性、降低丙二醛（MDA），结论为PUE剂量依赖性抑制过度自噬和氧化应激。
2. 单细胞转录组分析揭示维持稳态小胶质细胞是PUE的核心细胞效应：scRNA-seq分析 sham、tMCAO和tMCAO+PUE组，共获得48,842个细胞并分为10类主要脑细胞；tMCAO减少小胶质细胞比例和数量，PUE恢复该群体；微胶质分为稳态、疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）、干扰素响应和增殖亚群，缺血选择性减少稳态微胶质而DAM未见显著改变，PUE恢复稳态微胶质及Tmem119、P2ry12、P2ry13、Csf1r、Cx3cr1、Hexb表达，IF证实Tmem119阳性微胶质恢复，结论为PUE优先维持稳态微胶质。
3. PUE减弱OGD/R BV2微胶质中的氧化应激和自噬：BV2细胞OGD/R后，PUE（6–24 μM）无细胞毒作用，二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、二氢乙锭（DHE）和MitoSOX检测显示PUE剂量依赖性降低胞内及线粒体ROS，单丹磺酰尸胺（MDC）和TEM显示减少自噬体，ROS清除剂NAC具类似效应，结论为PUE直接抑制微胶质氧化应激和过度自噬。
4. 转录组分析确定JAK2/STAT3信号是PUE介导神经保护的关键调控轴：微胶质整合转录组分析发现1,741个tMCAO上调且PUE逆转的基因，KEGG/GO富集于神经退行性、核糖体、氧化磷酸化及线粒体功能；JAK2和STAT3主要表达于微胶质且tMCAO后升高，qPCR、WB和IF显示PUE降低JAK2、STAT3及p-JAK2、p-STAT3，并减少Tmem119阳性微胶质中JAK2/STAT3过表达，结论为JAK2/STAT3是PUE作用相关调控枢纽。
5. JAK2缺失减轻急性CIRI并抑制自噬相关蛋白表达：AAV9-shJAK2经脑室注射敲低JAK2后，tMCAO大鼠梗死体积降低、线粒体完整性改善、自噬体减少；DIA蛋白质组学显示3,335个差异蛋白（1,953上调、1,382下调），GO/KEGG富集于自噬相关过程，qPCR显示ATG3、ATG5、ATG12降低；荧光素酶报告显示Butyzamide增强ATG5、ATG12启动子活性，AG490抑制ATG3、ATG5启动子活性，结论为JAK2/STAT3参与调控自噬相关基因，JAK2缺失具保护作用。
6. PUE通过JAK2/STAT3失活在BV2微胶质中抑制氧化应激和自噬：在OGD/R BV2中，PUE改善细胞活力，效果类似AG490，而Butyzamide取消该保护；PUE降低胞内和线粒体ROS、抑制自噬并保护线粒体结构，AG490重现而JAK2/STAT3激活逆转；WB显示Butyzamide逆转PUE对LC3、ATG3、ATG5、ATG12的上调抑制，结论为PUE抗氧化和抗自噬作用依赖JAK2/STAT3抑制。
7. PUE通过JAK2/STAT3抑制减轻体内微胶质自噬和脑损伤：tMCAO大鼠中PUE减少梗死体积、改善组织病理并减少自噬体，Butyzamide部分取消这些保护；qPCR和WB显示PUE降低LC3、ATG3、ATG5、ATG12，JAK2/STAT3激活削弱此抑制；IF显示PUE使Tmem119阳性稳态微胶质中ATG3、ATG5、ATG12降低，结论为体内抑制JAK2/STAT3对PUE保护急性CIRI至关重要。
8. 经PUE处理的微胶质通过JAK2/STAT3依赖性细胞间信号向神经元提供神经保护：BV2–HT22 Transwell共培养中，PUE处理微胶质降低OGD/R神经元ROS、线粒体氧化应激和自噬并改善活力；微胶质JAK2/STAT3激活取消此神经保护，而JAK2/STAT3抑制重现保护，结论为PUE通过JAK2/STAT3依赖性微胶质重编程间接保护神经元。
讨论部分总结认为，PUE选择性恢复Tmem119/P2ry12阳性稳态微胶质而不显著改变DAM，提示其靶向维持微胶质稳态而非全局免疫抑制；PUE降低胞质和线粒体ROS、抑制自噬体形成并下调ATG3、ATG5、ATG12，将微胶质界定为PUE抗氧化和抗自噬作用的重要细胞靶点；JAK2/STAT3作为上游调控轴，药理学激活逆转PUE保护而JAK2敲低复制其保护表型，且JAK2/STAT3调控ATG3/5/12启动子活性，将JAK2/STAT3激活与过度自噬和线粒体ROS生成联系起来；PUE处理微胶质可减轻共培养神经元氧化应激和自噬，而微胶质JAK2/STAT3激活取消该旁分泌保护，说明JAK2/STAT3依赖的微胶质状态影响神经元命运。原文同时指出局限：PUE为tMCAO前及再灌注期间给药，属预处理导向方案而非临床相关缺血后处理；PUE与Butyzamide在OGD/R中同时给药，尚不能判断PUE能否逆转已建立的JAK2/STAT3激活；体外主要依赖BV2细胞，需原代微胶质验证；AAV9-shJAK2经脑室注射可能影响多种脑细胞，虽免疫荧光确认微胶质JAK2敲低，但体内结果应解释为脑JAK2信号作用而非明确的微胶质特异性效应。
研究结论翻译：总之，该研究提出统一机制模型，即PUE通过抑制JAK2/STAT3信号维持微胶质稳态，从而抑制过度自噬和氧化应激，并最终在急性CIRI中保护神经元完整性；该以小胶质细胞为中心的机制为PUE的细胞特异性提供了新认识，并突出JAK2/STAT3作为缺血性卒中早期干预的有前景治疗靶点。