方向感知图注意力建模与共表达整合揭示了水稻叶片中干旱和盐胁迫共享响应的新核心调控因子

《Plant Science》：Direction-aware graph attention modeling and co-expression integration reveal novel core regulators of shared drought and salinity stress responses in rice leaves

　　

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  一种方向和符号感知的图注意力网络（GAT）框架重建了以转录因子为中心的水稻基因调控网络。
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  转录因子锚定的有向签名图注意力残差网络（TF-Anchored Directed SiGaResNet）实现了高预测能力（AUC = 0.95）。
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  推断出的基因调控网络呈现稀疏、模块化的拓扑结构，且转录因子显著富集。
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  加权基因共表达网络分析（WGCNA）独立验证了18个优先转录因子。
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  鉴定出四个新颖的候选转录因子（Os07g0176200、Os05g0569300、Os03g0231000、Os02g0187700），并通过qRT-PCR在盐分和干旱胁迫下获得了实验支持。

引言

水稻（Oryza sativa L.）是全球大量人口的主食，尤其在东亚、南亚、中东、拉丁美洲和西印度群岛地区。据估计，这种谷物为全球人类提供超过20%的总热量摄入（Zhang et al., 2024）。除了热量密度之外，水稻在主要谷物中以含有相对较高的必需微量营养素（包括维生素和矿物质）而著称，这增强了其在粮食安全中的营养重要性（TAGLIAPIETRA et al., 2024）。然而，水稻种植的可持续性日益受到土壤盐分化和干旱等非生物胁迫的威胁，这些胁迫显著限制了产量潜力，并在许多水稻种植地区限制了种植面积扩张（Huanhe et al., 2024）。

在各种环境胁迫因子中，干旱和盐分化是阻碍植物生长和农业生产力的首要障碍（Angon et al., 2022, Li et al., 2024, Gammanpila et al., 2025）。水稻种植对盐渍侵入尤为脆弱，这一威胁在全球范围内日益加剧，因为人为和环境驱动因素不断恶化灌溉土地质量，目前影响全球五分之一的农业土壤（Saleem et al., 2025）。高盐度的主要细胞受害是离子稳态崩溃；过量的Na⁺内流取代了必需的K⁺和Ca²⁺离子，引发一系列代谢功能障碍，最终导致氧化应激和细胞凋亡（Balasubramaniam et al., 2023）。此外，盐分胁迫通过气孔和非气孔限制损害了初级碳固定机制。虽然渗透失衡最初通过气孔关闭限制了CO₂的可用性（Fernando et al., 2025），但随后的离子阶段对光合作用基础设施造成不可逆的损伤。其特征是叶绿体超微结构的瓦解、严重的叶绿素缺乏以及关键光合膜蛋白的降解（Wang et al., 2025, Woodson, 2022）。干旱被定义为严重的土壤水分亏缺，将水可用性限制在不足以维持植物充分生长和完成其生活周期的水平（Sharma and Kumar, 2023）。这种水分限制往往伴随土壤溶液中可溶性盐分的渐进性蒸发浓缩，从而对根区同时施加干旱和盐分胁迫（Naorem et al., 2023）。

转录因子（TFs）是协调水稻对干旱和盐分胁迫响应的核心调控因子。NAC、DREB/CBF、bZIP、WRKY和MYB家族的成员激活或抑制一系列下游基因，这些基因参与渗透调节、离子稳态、活性氧（ROS）清除和气孔调节，从而增强水稻的胁迫耐受性（Xiong et al., 2025, U?arl?, 2025）。这些转录因子所调控的网络构成了高度互连的基因调控模块，整合了多条信号通路（Imran et al., 2025）。这些转录因子作为复杂基因调控网络（GRNs）的组成部分而发挥作用。此类网络提供了系统层面的综合视角，揭示调控级联如何跨越多个分子层次传递胁迫信号，最终塑造胁迫适应性表型（Karimi-Fard, 2026）。因此，绘制转录因子与其靶基因之间在这些基因调控网络中的特定相互作用，对于阐明植物适应非生物胁迫的潜在分子机制至关重要。

虽然差异表达分析（DEA）仍是检测胁迫响应基因的常用策略，但它主要生成差异表达基因（DEGs）目录，在揭示潜在调控架构（如调控方向、层次组织以及调控因子与其靶标之间的功能依赖关系）方面存在不足（Guo and Xiao, 2024, Karimi-Fard, 2026）。当在非生物胁迫的多重背景下检验调控响应时，这些不足尤为显著，此时基因表达模式具有强烈的背景特异性，可能受到信号通路间复杂非线性交互作用的影响（Lu et al., 2024）。因此，仅以差异表达基因为中心的方法往往忽略因果调控关系，凸显了先进整合策略的必要性，以重建功能相关的基因调控网络（Kim et al., 2023）。

为解决这些局限性，我们此前开发了有向签名图注意力残差网络（Directed SiGaResNet），这是一种具备签名和方向感知能力的图注意力残差网络，可直接从转录组数据重建基因调控网络。虽然该框架在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中重建ABA响应网络时展现了令人信服的性能（Karimi-Fard, 2026），但它存在若干架构和分析方面的约束。

在本研究中，我们引入了该框架的显著增强版本——转录因子锚定的有向签名图注意力残差网络（TF-Anchored Directed SiGaResNet），并首次将其应用于水稻（Oryza sativa L.）——一种全球重要的主粮作物，使用独立的干旱和盐分胁迫转录组数据集的整合荟萃分析。通过全面的跨研究转录组荟萃分析，重建了一个调控网络，整合了这两种主要非生物胁迫的单重和交互效应。与原始框架相比，纳入了四项关键方法学改进：(i) 在每个有向/签名GATv2流中增加一个额外的残差二跳注意力层，以捕获间接调控级联；(ii) 用类加权焦点损失与基于Youden指数的阈值优化替代标准交叉熵，以更好地处理严重的类别不平衡；(iii) 事后温度缩放以获得校准的置信度分数；(iv) 将转录因子锚定的边保留策略与严格的基于置换的零模型（500次度保持随机化）相结合，以统计学验证网络模块化。

综上所述，从拟南芥中单一物种/单一胁迫模型到水稻中多重胁迫调控网络的转变，结合上述架构和分析增强，为解析水稻适应盐和干旱复合胁迫的层次性和方向性调控机制提供了更稳健且更具生物学意义的框架。

章节摘要

转录因子锚定的图神经网络系统级架构与多层验证流程

为解析水稻（Oryza sativa L.）叶片组织对干旱和盐分胁迫响应的复杂转录调控景观，我们开发了一个将深度学习与多组学生物学相结合的全面综合框架。本研究的整体工作流程示意图见图1。

数据收集

从NCBI GEO数据库中收集了水稻（Oryza sativa L.）在干旱和盐分胁迫下的叶片特异性RNA-Seq表达数据。检索策略如下：

有效消除整合水稻转录组数据集中的研究特异性批次效应

为评估跨研究异质性并评价批次效应校正流程的效率，在计算调和前后分别进行了主成分分析（PCA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）。校正前，整合数据集之间观察到明确分离（PC1：31.8%方差；PC2：27.5%方差）（图3a），其中生物学样本严格按照其来源研究进行聚类

讨论

在盐分胁迫下鉴定出719个差异表达基因，且以上调为主（56.3%），凸显了水稻中稳健适应性转录程序的激活。诱导最强的基因Os11g0454300编码水胁迫诱导蛋白Rab21，与其作为多种非生物胁迫响应关键效应因子的已知作用一致。既往研究表明，Rab21对干旱、冷胁迫和ABA信号具有强烈响应性（Jitsamai

结论

在本研究中，我们将转录因子锚定的有向签名图注意力残差网络（TF-Anchored Directed SiGaResNet）——一种扩展的签名和方向感知图注意力框架——应用于水稻叶片独立干旱和盐分胁迫转录组数据集的整合分析，以推断以转录因子为中心的调控网络。该模型展现了强大的交叉验证分类性能，并鉴定出一个稀疏的、具有统计学显著模块性的网络，其中转录因子在网络上游节点中显著富集

伦理声明

本文报道的研究不涉及人类受试者、动物实验或任何其他需要伦理审批的程序。

CRediT作者贡献声明

Mahdieh Safarzadeh：可视化、调查研究、数据整理。Masoud Tohidfar：撰写——初稿、验证、正式分析。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者声明本研究在未获得任何机构财政支持的情况下进行。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

Mahdieh Safarzadeh|Masoud Tohidfar