《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Transient Cry1Ac expression in
Hydrilla verticillata reduces
Parapoynx diminutalis survival and is associated with midgut injury and altered digestive physiology
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摘要金鱼藻（Hydrilla verticillata）作为淡水生态系统中的关键物种和虾蟹养殖的主要饵料植物，在维持水质和支撑区域渔业方面发挥着重要作用。然而，卷叶螟Parapoynx diminutalis的频繁暴发严重削弱了其生态服务功能和养殖应用价值。传统化学防治在水生
摘要
金鱼藻（Hydrilla verticillata）作为淡水生态系统中的关键物种和虾蟹养殖的主要饵料植物，在维持水质和支撑区域渔业方面发挥着重要作用。然而，卷叶螟Parapoynx diminutalis的频繁暴发严重削弱了其生态服务功能和养殖应用价值。传统化学防治在水生环境中的局限性凸显了开发环境友好型、具有生物抗性的品种的迫切需求。本研究建立了高效再生体系以及基于农杆菌介导的金鱼藻瞬时表达策略，以评估基于Cry1Ac抗性改良的可行性。在所测试的外植体类型中，茎尖表现出最高的数值再生率（96.30 ± 6.41%）。在多种苏云金芽孢杆菌（Bt）蛋白中，Cry1Ac对卷叶螟幼虫表现出最高毒性（LC50 = 0.086 mg/L）。通过构建pCAMBIA3301-Ubi-Cry1Ac载体并优化农杆菌介导感染条件，成功实现了Cry1Ac在金鱼藻组织中的瞬时表达，ELISA检测到Cry1Ac蛋白水平为251.60 ng/g鲜重。取食表达Cry1Ac组织的幼虫存活率显著降低。暴露7天后的转录组分析鉴定出213个差异表达基因，其中188个下调，主要涉及消化、解毒、氧化还原代谢、膜转运、细胞骨架调控和能量代谢。24和48小时的RT-qPCR分析进一步证实了选定基因的时间依赖性转录响应。H&E染色显示幼虫中肠上皮明显受损；存活幼虫中胰蛋白酶样蛋白酶和氨基肽酶N（APN）活性分别显著增加59.1%和221%，而糜蛋白酶样蛋白酶活性无显著变化，表明在长期Cry1Ac暴露过程中，消化生理发生了选择性重塑而非消化酶活性的普遍抑制。综上，本研究为沉水高等植物中Cry1Ac瞬时表达的可行性提供了概念验证，并表明其杀虫作用伴随着中肠结构损伤以及消化和应激响应过程的重塑。
引言
金鱼藻（Hydrilla verticillata）是雨久花科的一种多年生沉水高等植物，具有高度的生态可塑性和跨多样化营养梯度的入侵潜力（Michel等，2004；Zhu等，2017）。其原产于古北界，现已广泛分布于淡水湖泊、河流及人工养殖池塘中（Zhu等，2017；Howell等，2026；Wang等，2024）。金鱼藻的生态价值是多方面的：首先，作为初级生产者，它通过高效光合作用提高溶解氧水平并稳定水质，具有可诱导的C4型碳浓缩机制（Van Ginkel等，2001）。其次，其庞大的生物量形成了结构复杂的沉水植被，为鱼类、甲壳类、无脊椎动物和水鸟提供了重要的觅食场所、产卵基质和避难所（Carniatto等，2014）。此外，金鱼藻在重金属富集和水体净化方面表现优异，能有效从沉积物和水层中吸收砷、镉和铜（Zhao等，2024；Yuan等，2022；Xue等，2010）。
在中国长江中下游地区，金鱼藻是中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）养殖中最受欢迎的水生植物（Wang等，2016；Ma等，2020；Zeng等，2021）。它为蜕壳提供安全环境，是一种不可或缺的自然绿色饵料。然而，目前这一生态和经济平衡正受到贪食性卷叶螟Parapoynx diminutalis的严重威胁（Antony等，2022；Bownes，2018）。卷叶螟是一种代表性的水生鳞翅目昆虫，其幼虫完全生活在水中，用叶片碎片构建管状茧，并大量取食金鱼藻的嫩梢和叶片。在虫害高峰期，卷叶螟可在短时间内造成金鱼藻大面积脱叶或死亡，导致溶解氧急剧下降，引发"翻塘"事件，造成重大经济损失（Antony等，2022；Bownes，2018）。
目前，卷叶螟的防治仍主要依赖合成化学农药。然而，水生环境的独特特性为化学防治带来了重大挑战：农药残留可直接影响虾蟹的健康或降低其市场价值，而频繁施药往往会导致杀虫剂抗性选择和水生生态系统生物多样性破坏（Butcherine，2021；Burch等，2025）。生物防治策略，如引入天敌或使用微生物制剂，提供了更安全的替代方案，但往往受到广阔水体稀释作用或紫外线降解的影响，难以实现精准和持久的控制（Baniszewski等，2016；Idris等，2024）。因此，利用现代分子工具将内源杀虫基因（如苏云金芽孢杆菌（Bt）晶体毒素）导入金鱼藻，是实现水生植被可持续保护和渔业发展的科学途径。更广泛地说，近期研究强调将微生物-植物-食草动物相互作用整合到害虫管理中，可能为开发可持续且生态兼容的作物保护策略提供新机遇（Zhang等，2025）。Bt Cry蛋白在杀虫谱和中肠结合特性方面存在显著差异。特别是Cry2Ab对多种鳞翅目害虫具有活性，其结合特性与Cry1毒素不同（Sivasupramaniam等，2008；Hernández-Rodríguez等，2008），可作为比较性Bt蛋白筛选的互补候选蛋白。
尽管基于Bt的生物技术在陆生作物保护中取得了变革性成功（Romeis等，2006），但其在沉水高等植物中的应用仍缺乏系统研究（Wang等，2025）。本研究首先建立了金鱼藻的快速离体增殖和再生平台，为分子改良提供技术基础。随后，我们系统比较了四种代表性Bt毒素——Cry1Ac、Cry2Ab、Cry1Ca和Cry1Fa——对水生鳞翅目害虫卷叶螟的杀虫活性，并确定Cry1Ac为本次概念验证瞬时表达的领先候选蛋白。因此，我们探讨了金鱼藻中Cry1Ac瞬时表达是否可降低幼虫存活率，并考察了卷叶螟的相关响应。为此，我们建立了农杆菌介导的瞬时表达体系，并整合了昆虫生物测定、7天转录组分析、24和48小时的时间序列RT-qPCR分析、中肠组织学检查和消化酶活性测定，以在转录、组织和生理水平上表征Cry1Ac相关的响应。
章节摘要
植物和昆虫材料
金鱼藻（Hydrilla verticillata）（L. f.）Royle样品采集于湖北省武汉市沙湖公园和查帕子鱼场。植物在含自来水的水族箱中培养，温度为28 ± 1 °C，光周期为16 h光照/8 h黑暗，每3天换水一次。水生鳞翅目害虫卷叶螟Parapoynx diminutalis Snellen采集于同一查帕子鱼场。幼虫在实验室水族箱中饲养，提供新鲜金鱼藻和恒定
茎尖外植体实现金鱼藻的高效无菌再生
经表面消毒后，成功建立了金鱼藻的稳定无菌培养物。茎尖外植体的再生过程在离体培养期间表现出持续的不定芽发育（图1A）。后续培养过程中未观察到微生物污染。当叶片外植体直接置于Luria-Bertani琼脂平板上时，未观察到可见菌落生长（图1B）。同样，叶片匀浆涂布于Luria-Bertani
讨论
本研究建立了适用于金鱼藻的农杆菌介导瞬时转化体系，为沉水单子叶植物的遗传操作提供了可行的技术基础。研究结果表明，玉米Ubi启动子能有效驱动该水生环境中高水平异源表达，产生可检测的Cry1Ac积累，并在饲喂生物测定中与幼虫存活率降低相关。在所测试的四种Bt蛋白中，Cry1Ac表现出最
CRediT作者贡献声明
李霞宇：方法学，数据整理。张艳萍：可视化，方法学。Owais Khan：方法学，调查研究。张立强：资源，项目管理，资金获取。何弯弯：验证，资金获取，写作——审阅与编辑。李霞宇：写作——初稿。
伦理审批
本研究仅涉及植物和无脊椎昆虫，未涉及人类受试者或脊椎动物。因此，无需伦理审批。
资金资助
本工作得到了武汉市农业科学院创新项目（QNCX202615）的资助。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
李霞宇|张艳萍|Owais Khan|张立强|何弯弯
武汉市农业科学院渔业研究所，武汉 430070，中国
