利用工程菌恶臭假单胞菌KT2440从甘油生物合成4-羟基戊酸及其在聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯-co-4-羟基戊酸酯)三聚物生产中的应用

《New Biotechnology》：Biosynthesis of 4-hydroxyvalerate from glycerol in engineered Pseudomonas putida KT2440 and its application for the production of Poly(3-hydroxybutyrate- co-3-hydroxyvalerate- co-4-hydroxy valerate) (P(3HB- co-3HV- co-4HV)) terpolymer

　　

中文摘要翻译 4-羟基戊酸（4HV）是合成可生物降解聚酯的单体之一，可调节其物理和机械性能。此外，4HV是γ-戊内酯（GVL）的前体，而GVL是生产液体运输燃料所用碳氢化合物的重要中间体。本研究首次建立了在工程菌恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440中从低成本底物甘油直接生物合成4HV的途径。研究人员通过在产左旋糖酸（LA）的P. putida KT2440 HP301菌株中引入内源的lvaE和lvaD基因，实现了从甘油到4HV的生物转化。通过补料分批发酵，最高4HV滴度达到28.77 mM。随后，研究人员将生物法合成的4HV（无需预先分离纯化）直接供给给表达广底物特异性PHA合酶（PhaCBP-M-CPF4）的富养罗尔斯通氏菌（Cupriavidus necator）PHB-4菌株，成功生产了高单体摩尔分数和高PHA含量（60.21%）的P(3HB-co-3HV-co-4HV)三聚物。研究表明，生物衍生4HV的引入显著改善了聚羟基脂肪酸酯（PHA）的断裂伸长率和热稳定性。该研究为可持续生产高性能生物塑料提供了一种有前景的策略。

论文主体内容解读

研究背景与问题

4-羟基戊酸（4HV）是一种重要的平台化学品，不仅作为合成可生物降解聚酯（如聚羟基脂肪酸酯PHA）的单体用于调控材料物理机械性能，同时也是γ-戊内酯（GVL）的前体，后者可用于生产液体运输燃料。传统上，4HV主要通过化学催化加氢的方法从左旋糖酸（LA）制备，但该方法存在固有缺陷：首先，4HV极易自发内酯化为热力学更稳定的GVL，导致选择性差、难以积累和回收；其次，化学催化过程通常需要高温、高压氢气、贵金属催化剂等苛刻条件，成本高昂且环境不友好。因此，开发一种绿色、可持续的生物合成路线替代化学法具有重要意义。此前的研究虽已实现利用全细胞生物催化或酶促反应从LA生产4HV，但这些方法依赖外源添加LA作为前体，且异源基因表达会给宿主细胞带来代谢负担，影响产量。虽然恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440拥有内源的LA利用操纵子（lvaABCDEF）可将LA转化为4HV，但LA本身的生产也面临挑战——传统化学水解法生产LA会产生甲酸、腐殖质等抑制性副产物，且条件苛刻。研究人员前期已成功在P. putida KT2440中构建了从甘油生物合成LA的途径，但尚未实现将LA进一步转化为4HV的一步式整合工艺。

研究内容与结论

为解决上述问题，研究人员设计了一条全新的生物合成路线：在已具备从甘油生产LA能力的工程菌P. putida KT2440 HP301（敲除了pcaIJ和lvaR，并在基因组整合了aroG、asbF和adc基因）基础上，通过引入内源的lvaD和lvaE基因，实现了从甘油直接生产4HV。LvaE是一种ATP和辅酶A依赖性的酰基辅酶A合成酶，负责将LA活化为左旋糖酰辅酶A；LvaD则是一种4-羟基戊酰辅酶A脱水酶，利用NAD(P)H将其还原为4HV-CoA，最终生成游离的4HV。研究结果表明，同时过表达lvaD和lvaE的菌株HP403在摇瓶水平上从甘油获得了最高的4HV滴度（9.61 mM），且中间产物LA残留量最低（1.73 mM）。在5升发酵罐中进行补料分批发酵，通过控制甘油浓度和pH值，最大4HV滴度达到了28.77 mM，证实了该策略在大规模生产中的潜力。然而，由于P. putida自身的II类PHA合酶对短链单体（如4HV）活性有限，且在营养丰富的条件下不利于PHA积累，该菌株自身的PHA积累量极低（仅0.09 g/L）。

为了高效利用生物法合成的4HV生产高性能PHA，研究人员采用了双菌株两步法策略。他们将P. putida KT2440 HP403产生的含4HV的培养上清液（无需纯化）直接作为前体，供给给另一株高产PHA的菌株——富养罗尔斯通氏菌（Cupriavidus necator）PHB^-4，该菌株表达了来自马来西亚红树林土壤宏基因组的广底物特异性PHA合酶PhaC_BP-M-CPF4。实验结果显示，当添加0.2%的生物衍生4HV时，C. necator成功合成了P(3HB-co-3HV-co-4HV)三聚物，其中4HV摩尔分数高达38.53%，PHA含量达到60.21%。与使用化学合成4HV相比，生物衍生4HV在相同添加量下获得了更高的4HV掺入比例。时间进程监测表明，3HV和4HV在培养72小时内持续积累。尽管高浓度4HV上清液对C. necator的生长有一定抑制作用（可能源于4HV本身的毒性及发酵液中其他成分），但总体而言，该策略有效证明了甘油衍生的4HV可作为合成高性能PHA三聚物的可行前体。

关键技术方法

1. 1.
   基因工程改造与菌株构建：采用同源重组技术（基于sacB自杀载体pK19mobsacB）对P. putida KT2440进行染色体DNA缺失突变（敲除pcaIJ和lvaR）和基因组整合（将aroG、asbF、adc整合至pcaIJ位点）。同时，利用T4克隆将内源基因lvaD和lvaE构建至广宿主质粒pBBR1MCS2中，电转化导入宿主菌。
2. 2.
   补料分批发酵：在5升发酵罐中以2升工作体积进行，初始培养基为含有4%甘油和0.5%酵母提取物的TB培养基，通过补加50%甘油和20%酵母提取物维持甘油浓度在4%，控制温度37℃、pH 7.0、溶氧20%。
3. 3.
   4HV环开环法：将γ-戊内酯（GVL）通过碱性水解（NaOH调至pH 12）开环生成4-羟基戊酸（4HVA），再调回pH 7.0后冻干确认，用于化学对照实验。
4. 4.
   PHA分析与表征：采用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）对PHA单体组成进行甲醇解分析；使用凝胶渗透色谱（GPC）测定聚合物分子量（Mn、Mw）及分散度；利用差示扫描量热法（DSC）测定玻璃化转变温度（Tg）、结晶温度（Tc）和熔融温度（Tm）；采用热重分析（TGA）评估热稳定性；使用万能试验机（UTM）测量拉伸强度、杨氏模量和断裂伸长率等力学性能。

研究结果分述

3.1 通过引入lvaE和lvaD比较P. putida KT2440的LA消耗与4HV生产**

研究发现，同时表达lvaD和lvaE的菌株（HP403）在补充50 mM LA的条件下，144小时后4HV滴度最高，达到44.15 mM，消耗了约一半的LA（26.12 mM）。相比之下，单独表达lvaE或lvaD的菌株以及空载体对照菌株的4HV产量仅有微弱增加。这表明lvaE和lvaD的协同表达显著增强了LA向4HV的转化效率，但仍需进一步优化以实现完全转化。

3.2 在P. putida KT2440中通过lvaD和lvaE表达实现基于甘油的4HV生产**

以甘油为唯一碳源时，共表达lvaD和lvaE的HP403菌株在144小时后4HV产量最高（9.61 mM），而中间产物LA积累最少（仅1.73 mM）。在补料分批发酵中，LA在48小时达到峰值9.58 mM后被迅速消耗并转化为4HV，84小时时4HV累积至最大值28.77 mM，发酵结束时仍保持22.15 mM。这证明引入lvaD和lvaE能有效将甘油转化为高价值平台分子4HV。但该菌株自身PHA积累量极低（仅0.09 g/L，含量不足1%），原因是其天然PHA合酶（PhaC1/PhaC2）偏好中长链单体，且培养条件不利于PHA储存。

3.3 在C. necator中利用化学合成LA和4HV生产P(3HB-co-3HV-co-4HV)三聚物的评估**

通过改变LA和4HV的浓度，系统评估了C. necator PHB^-4/PhaC_BP-M-CPF4菌株合成三聚物的能力。随着LA浓度从0.1%增至0.4%，3HV和4HV的积累量同步上升，在0.4% LA时获得了P(51.5 mol% 3HB-co-12.31 mol% 3HV-co-36.19 mol% 4HV)的三聚物。而单独使用甘油时，只产生PHB均聚物，无3HV或4HV掺入。使用化学合成的4HVA作为前体时，在0.5%浓度下得到了P(43.99 mol% 3HB-co-12.55 mol% 3HV-co-43.46 mol% 4HV)的三聚物。

3.4 在C. necator中利用生物衍生4HV上清液合成P(3HB-co-3HV-co-4HV)三聚物**

将P. putida HP403的培养上清液（含生物衍生4HV）直接添加到C. necator培养基中。在0.1% 4HV浓度下，获得P(74.66 mol% 3HB-co-3.48 mol% 3HV-co-21.86 mol% 4HV)，PHA含量40.25%；在0.2%浓度下，PHA含量提升至60.21%，4HV摩尔分数达38.53%。值得注意的是，生物衍生4HV在相同添加量下比化学4HV实现了更高的4HV掺入比例（0.1%时21.86% vs 15.17%）。时间过程显示，3HV和4HV在72小时内持续积累，但高浓度上清液因含有毒代谢副产物会抑制细胞生长。

3.5 含3HV和4HV的PHA薄膜物理化学性质分析

通过对不同组成的三聚物薄膜进行热力学和力学性能测试，发现4HV的引入显著降低了PHA的熔融温度（Tm）和结晶温度（Tc），同时提高了断裂伸长率，改善了材料的柔韧性和加工性能。热重分析（TGA）表明4HV的加入并未降低材料的热分解温度，反而在一定程度上提升了热稳定性。这些特性使该三聚物在包装、医疗等需要柔韧性和热稳定性的领域具有应用潜力。

讨论与结论

本研究首次报道了在工程菌P. putida KT2440中建立从廉价底物甘油直接生物合成4HV的完整途径，并通过双菌株策略成功将其应用于高性能PHA三聚物的生产。研究结论指出：通过引入内源lvaE和lvaD基因，结合前期构建的LA生物合成模块，实现了从甘油到4HV的高效转化，补料分批发酵最高滴度达28.77 mM。将生物法生产的4HV（不经纯化）直接供给表达广谱PHA合酶的C. necator，成功合成了具有高4HV摩尔分数（最高43.46%）和高PHA含量（60.21%）的P(3HB-co-3HV-co-4HV)三聚物。生物衍生4HV的引入不仅改善了PHA的断裂伸长率和热稳定性，还避免了化学催化过程中昂贵催化剂和苛刻条件的使用。该研究为从可再生资源出发、以绿色可持续的方式生产高性能生物塑料提供了新的思路和可行的技术路径。