《Neoplasia》：TMPRSS4 promotes cancer stem-like properties in colon and lung cancers through transcriptional and post-transcriptional upregulation of KRAS
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跨膜丝氨酸蛋白酶4（transmembrane serine protease 4，TMPRSS4）与多种癌症（包括非小细胞肺癌、胰腺癌和结直肠癌）的不良预后相关。研究人员此前已表明，TMPRSS4在前列腺癌中以依赖于上皮-间质转化（epithelial–me
跨膜丝氨酸蛋白酶4（transmembrane serine protease 4，TMPRSS4）与多种癌症（包括非小细胞肺癌、胰腺癌和结直肠癌）的不良预后相关。研究人员此前已表明，TMPRSS4在前列腺癌中以依赖于上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）转录因子的方式促进癌症干细胞样特性。在本研究中，研究人员鉴定了一条驱动结肠癌和肺癌癌症干细胞样特征及肿瘤发生的新的TMPRSS4–EMT转录因子–KRAS轴。TMPRSS4敲低可抑制肿瘤生长和癌症干细胞样特性，伴随KRAS表达降低以及ERK1/2和AKT磷酸化减少，这与转录组学分析显示TMPRSS4激活RAS、MAPK和PI3K–AKT信号通路的结果一致。在机制层面，EMT诱导转录因子SLUG和TWIST1是TMPRSS4介导的KRAS上调所必需的。这些因子通过KRAS内含子1调控区内的E-box元件增强KRAS转录，并通过抑制靶向KRAS的miR-200c在转录后水平增加KRAS表达。在临床上，TMPRSS4表达与KRAS表达呈正相关，且TMPRSS4和KRAS的共表达与多种癌症的不良生存相关。综上，这些发现揭示了一条此前未被认识的促进肿瘤进展的TMPRSS4–SLUG/TWIST1–KRAS通路，并凸显TMPRSS4–KRAS轴作为KRAS突变和/或表达升高驱动的癌症的潜在治疗靶点。
RAS蛋白是一类小GTP酶（small GTPase），作为分子开关调控细胞生长、分化和存活，主要通过PI3K（phosphoinositide 3-kinase，磷脂酰肌醇3-激酶）/AKT（protein kinase B，蛋白激酶B）和MAPK（mitogen-activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶）等下游信号通路发挥作用。KRAS是RAS家族中最常发生突变的基因，约占所有RAS突变的86%，见于约30%的肿瘤，在胰腺癌、肺癌和结直肠癌中尤为常见；除点突变外，KRAS基因扩增和野生型（wild-type，WT）KRAS过表达也可驱动肿瘤发生，提示KRAS信号具有剂量依赖性。跨膜丝氨酸蛋白酶4（transmembrane serine protease 4，TMPRSS4）属于II型跨膜丝氨酸蛋白酶（type II transmembrane serine protease，TTSP）家族成员，在多种癌症中高表达并与不良预后相关。研究人员此前已报道TMPRSS4在前列腺癌中通过SLUG和TWIST1等EMT（epithelial–mesenchymal transition，上皮-间质转化）转录因子上调SOX2，从而促进癌症干细胞样特性；然而，TMPRSS4在结肠癌和肺癌中驱动癌症干细胞（cancer stem cell，CSC）特性的分子机制尚不清楚。针对这一科学问题，本研究旨在阐明TMPRSS4在结肠癌和肺癌中促进CSC特征和肿瘤发生的分子机制，重点关注TMPRSS4与KRAS之间的调控联系。
研究人员发现了一条新的TMPRSS4–SLUG/TWIST1–KRAS调控轴：TMPRSS4通过SLUG和TWIST1在转录水平直接结合KRAS内含子1中的E-box元件，并在转录后水平抑制靶向KRAS的miR-200c，从而双重上调KRAS表达，进而激活ERK1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，细胞外信号调节激酶1/2）和AKT信号通路，促进癌症干细胞样特性和肿瘤生长。临床数据表明TMPRSS4表达与KRAS表达呈正相关，二者共表达与多种癌症的不良生存相关。该研究为KRAS突变和/或表达升高驱动的癌症提供了新的潜在治疗靶点。
在技术方法层面，研究人员使用美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）来源的结肠癌细胞系（HCT-116、HCT-15、HT-29）和肺癌细胞系（NCI-H358、NCI-H1975、NCI-H1650、NCI-H322、SK-MES-1）等，主要方法包括RNA测序（RNA-seq）及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析、免疫印迹、KRAS活性测定（Raf1 RBD pull-down）、KRAS启动子和3′-非翻译区（
3′-untranslated region，
3′-UTR）报告基因分析、染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）、肿瘤球形成实验、乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）活性检测、软琼脂集落形成实验、小鼠异种移植模型，以及基于癌症细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）、癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和KM-plotter数据库的生信分析。
研究结果如下：
（1）TMPRSS4抑制降低结肠癌和肺癌细胞的肿瘤生长及癌症干细胞样特性。通过肿瘤球形成实验和ALDEFLUOR实验发现，TMPRSS4敲低可减少HT-29、HCT-116和HCT-15结肠癌细胞以及NCI-H1650、NCI-H1975和NCI-H358肺癌细胞的肿瘤球形成和ALDH活性。在HCT-116和NCI-H1975异种移植模型中，瘤内注射TMPRSS4特异性shRNA（short hairpin RNA，短发夹RNA）载体显著抑制肿瘤生长，肿瘤组织中TMPRSS4、SLUG、TWIST1、SOX2表达及ERK1/2和AKT磷酸化水平均降低，KRAS表达亦同步下降。
（2）TMPRSS4促进KRAS表达和ERK1/2及AKT磷酸化，驱动癌症干细胞样特性。RNA-seq和KEGG分析显示TMPRSS4表达与RAS、MAPK和PI3K–AKT信号通路显著相关；免疫印迹和KRAS活性检测证实TMPRSS4敲低降低KRAS表达及GTP结合型KRAS水平。功能实验表明，KRAS G12C/G12D过表达可逆转TMPRSS4敲低引起的ALDH活性降低、肿瘤球形成减少、锚定非依赖性生长受抑及化疗敏感性增加等表型，而KRAS敲低则可削弱TMPRSS4过表达引起的促干性效应，证明KRAS是TMPRSS4驱动CSC特性的关键下游介质。
（3）SLUG和TWIST1是TMPRSS4介导的KRAS表达及其下游信号所必需。在NCI-H358细胞中，SLUG或TWIST1过表达可逆转TMPRSS4敲低引起的KRAS下调及ERK1/2/AKT磷酸化降低；单独过表达SLUG或TWIST1即可上调KRAS和SOX2表达并增强ERK1/2/AKT磷酸化，而敲低内源性SLUG或TWIST1则产生相反效果。
（4）SLUG和TWIST1通过E-box元件上调KRAS转录。报告基因实验和ChIP实验表明，SLUG和TWIST1直接结合KRAS内含子1调控区（+1275/+1454），通过其中的CATCTG E-box元件（+1365/+1370）激活KRAS转录；该E-box突变显著削弱SLUG/TWIST1介导的KRAS启动子活性。
（5）SLUG和TWIST1通过抑制miR-200c增强KRAS 3′-UTR活性。TMPRSS4敲低可升高miR-200c水平并降低KRAS 3′-UTR报告基因活性，miR-200c抑制剂可逆转该效应。SLUG和TWIST1可结合miR-200c启动子中的E-box元件（SLUG主要作用于?543/?538位点，TWIST1主要作用于?370/?365位点）转录抑制miR-200c，从而解除其对KRAS的翻译抑制；KRAS前体mRNA和成熟mRNA水平对比分析进一步证实了转录和转录后双重调控机制。
（6）TMPRSS4与KRAS在人类癌症中的临床意义。CCLE数据分析显示，TMPRSS4与KRAS的mRNA表达（n=1156，rho=0.17，P=6.22E-09）和蛋白表达（n=375，rho=0.316，P=1.53E-05）均呈正相关；TCGA肺癌鳞癌和结肠癌数据亦显示二者蛋白水平正相关。基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）表明TMPRSS4表达与KRAS信号上调显著相关。生存分析显示，TMPRSS4和KRAS高表达均为肺癌患者不良生存的显著预测因子，二者共同高表达者预后更差。
讨论部分指出，KRAS G12C靶向抑制剂（sotorasib和adagrasib）虽已进入临床应用，但原发或获得性耐药仍限制其疗效。TMPRSS4作为KRAS的上游调节因子，可同时作用于野生型和突变型KRAS，因此靶向TMPRSS4可能为KRAS驱动型癌症（如结直肠癌、肺癌和胰腺癌）提供间接靶向KRAS的替代策略，并可能有助于克服EGFR TKI（tyrosine kinase inhibitor，酪氨酸激酶抑制剂）及化疗耐药。此外，KRAS的转录调控机制此前研究甚少，本研究首次揭示经典EMT转录因子SLUG/TWIST1可直接结合KRAS内含子1中的E-box元件增强KRAS转录，填补了该领域空白。研究还提示TMPRSS4可能通过调控PD-L1表达影响肿瘤免疫微环境，但相关机制有待进一步研究。
研究结论翻译：综上所述，研究人员证实了一条既往未被认识的TMPRSS4–KRAS调控轴。TMPRSS4上调KRAS表达并激活包括ERK1/2和AKT在内的下游信号通路，从而促进化疗耐药和肿瘤生长等癌症干细胞样特性。在机制上，核心EMT诱导转录因子SLUG和TWIST1通过结合KRAS内含子1中的E-box元件增强KRAS转录，并通过抑制靶向KRAS的miR-200c在转录后水平增加KRAS表达，从而介导TMPRSS4诱导的KRAS上调。这些发现鉴定了一条介导TMPRSS4相关癌症进展的新分子通路，并凸显TMPRSS4作为减弱肺癌和结肠癌以及由KRAS激活和/或表达升高驱动的其他恶性肿瘤中KRAS信号的潜在治疗靶点。
