PPT1介导的GABAARα1去棕榈酰化维持抑制性突触稳态与认知功能

《Neurobiology of Disease》：PPT1-mediated GABA ARα1 depalmitoylation maintains inhibitory synaptic homeostasis and cognition

　　

GABAA受体（GABAARs）是抑制性神经传递所必需的一类棕榈酰化蛋白，其去棕榈酰化过程由棕榈酰蛋白硫酯酶1（PPT1）催化。研究人员构建了携带破坏GABAARα1与PPT1相互作用的突变的Gabra1em1敲入小鼠，发现突变小鼠表现出学习和记忆损伤，但其潜在细胞机制仍大体不明。分子分析显示，杂合（HET）Gabra1em1小鼠（Gabra1em1HET）的GABAARα1蛋白表达正常，但GABAARα1呈现持续性高棕榈酰化。电生理记录显示神经元兴奋性降低、抑制性突触传递增强以及海马长时程增强（LTP）受损。行为学分析进一步揭示学习、记忆和社交行为缺陷。纯合（HOMO）Gabra1em1小鼠（Gabra1em1HOMO）则表现出GABAARα1蛋白表达的显著降低，伴随神经元兴奋性和兴奋性突触传递增强，同时存在LTP受损、学习记忆缺陷以及寿命缩短。总体而言，这些发现表明Gabra1em1HET小鼠是研究蛋白质棕榈酰化生理和病理作用的宝贵模型，因为异常的GABAARα1棕榈酰化在不改变受体表达的情况下扰乱了神经元兴奋性、突触可塑性和认知功能。相比之下，Gabra1em1HOMO小鼠所表现的表型主要归因于GABAARα1蛋白表达的显著减少，进而损害突触可塑性和学习记忆。这些发现为蛋白质棕榈酰化在神经系统疾病中的作用提供了新的机制见解，并为开发靶向棕榈酰化稳态的精准治疗策略奠定了理论基础。

蛋白质棕榈酰化是一种可逆的脂质修饰，通过将棕榈酸共价连接至蛋白质半胱氨酸残基，动态调节蛋白的定位与功能，对神经元发育和突触可塑性至关重要。该修饰的动态平衡由DHHC家族棕榈酰转移酶与去棕榈酰化酶协同维持；其失衡可导致蛋白质运输异常和突触功能障碍，并与神经元蜡样脂褐质沉积症（NCL）、阿尔茨海默病（AD）、自闭症谱系障碍（ASD）和癫痫等多种神经系统疾病相关。GABAA受体是介导快速抑制性突触传递的关键蛋白，其α1亚基（GABAARα1）是成年脑内最丰富的亚型，调控神经元兴奋性并支持高阶脑功能。GABAARα1胞内环存在棕榈酰化位点，已有研究表明GABAA受体的棕榈酰化参与调节受体聚集与细胞表面稳定性，是GABA能抑制性突触正常组装和功能所必需。然而，α1亚基棕榈酰化对神经元兴奋性和突触可塑性的具体影响尚不清楚。PPT1作为中枢神经系统主要的去棕榈酰化酶，不仅定位于溶酶体，还富集于神经元突触体，介导突触蛋白的动态去棕榈酰化。在PPT1突变敲入小鼠中，研究人员观察到GABAARα1棕榈酰化增加、异常γ振荡和癫痫样放电，提示PPT1可能是GABAARα1的去棕榈酰化酶。尽管LTP受损与多种认知疾病相关，且兴奋-抑制（E/I）平衡对正常脑功能至关重要，但PPT1-GABAARα1去棕榈酰化轴是否调节E/I平衡与突触可塑性仍是未解问题。为此，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了携带GABAARα1上PPT1结合位点（Cys165和Cys179）突变的Gabra1em1敲入小鼠，系统探究了GABAARα1去棕榈酰化在神经元兴奋性、突触传递、突触可塑性和认知功能中的生理与病理作用。

研究人员采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在C57BL/6N背景下构建Gabra1em1敲入小鼠（p.C165S、p.C179S突变），并通过繁殖获得杂合子（Gabra1em1HET）与纯合子（Gabra1em1HOMO）小鼠。主要技术方法包括：酰基-生物素交换（ABE）实验结合Western blot检测GABAARα1的棕榈酰化水平和蛋白表达；急性海马脑片全细胞膜片钳记录动作电位、电压门控Na⁺/K⁺电流、自发性兴奋性/抑制性突触后电流（sEPSCs/sIPSCs）及微小抑制性突触后电流（mIPSCs）；细胞外场电位记录海马CA1区场兴奋性突触后电位（fEPSP）和LTP；行为学测试包括Y迷宫、新物体识别（NOR）、三箱社交、旷场（OFT）和高架十字迷宫（EPM）。所有数据采集采用盲法，小鼠随机分组。

3.1 Gabra1em1小鼠模型的表型特征（Phenotypic characterization of the Gabra1em1 mouse model）：通过CRISPR/Cas9技术成功构建Gabra1em1敲入小鼠，Sanger测序确认HET和HOMO基因型。Kaplan-Meier生存曲线显示HOMO小鼠存活率显著降低且体重增长缓慢，而HET小鼠与野生型（WT）无明显差异，表明这两个半胱氨酸残基对维持整体生理稳态具有重要作用。

3.2 GABAARα1半胱氨酸突变降低CA1锥体神经元兴奋性（GABAARα1 Cys-mutations decrease CA1 pyramidal neuron excitability）：通过海马脑片电流钳记录，HET小鼠在去极化电流注入下动作电位（AP）发放减少，AP半宽增加，电压门控Na⁺电流密度降低，而K⁺电流及基础膜特性无显著变化，表明HET小鼠CA1锥体神经元兴奋性降低；HOMO小鼠则表现为AP发放增加、半宽减小，即兴奋性增强。

3.3 GABAARα1半胱氨酸突变改变突触传递（GABAARα1 Cys-mutations altered synaptic transmission）：通过全细胞电压钳记录，HET小鼠sEPSC频率和幅度无改变，但sIPSC幅度和频率均增加，mIPSC幅度增加而频率不变，提示抑制性突触传递增强；HOMO小鼠sEPSC频率和幅度显著增加，sIPSC无显著变化，提示兴奋性突触传递增强。

3.4 GABAARα1半胱氨酸突变改变GABAARα1棕榈酰化水平与突触蛋白表达（GABAARα1 Cys-mutations alter GABAARα1 palmitoylation levels and synaptic protein expression）：ABE实验显示HET小鼠GABAARα1棕榈酰化水平显著升高，但mRNA和总蛋白水平不变，膜/胞质分布无差异；Western blot显示GluA1和GABAARα2表达降低。HOMO小鼠GABAARα1 mRNA不变但蛋白表达显著下降，膜和胞质部分均减少，同时GluA1升高、GluN2A和GluN2B降低。

3.5 GABAARα1半胱氨酸突变损害LTP（GABAARα1 Cys-mutations impair LTP）：细胞外场电位记录显示，高频刺激（HFS）后HET和HOMO小鼠海马CA1区fEPSP斜率均显著低于WT，HET小鼠输入-输出（I-O）曲线也降低，表明两种基因型均存在LTP诱导受损。

3.6 GABAARα1半胱氨酸突变损害记忆（GABAARα1 Cys-mutations impair memory）：Y迷宫测试中，HET小鼠在1小时和24小时测试中进入新异臂的次数减少，1小时停留时间和总距离也减少；NOR测试中HET小鼠短期和长期记忆的辨别指数（DI）和偏好指数（PI）均显著低于WT；OFT和EPM测试中两组无显著差异，排除了自发活动异常和焦虑样表型的影响。

3.7 GABAARα1突变损害社交行为（GABAARα1 mutation impairs social behavior）：三箱社交测试中，HET小鼠在社交性阶段对陌生鼠的偏好显著降低，但在社交新颖性偏好和长期社交记忆阶段与WT无显著差异；HOMO小鼠同样表现出社交互动行为受损。

讨论部分总结指出，Gabra1em1HOMO小鼠由于GABAARα1蛋白表达严重减少，导致神经网络过度兴奋和E/I平衡破坏，LTP及学习记忆受损，寿命缩短。Gabra1em1HET小鼠则因去棕榈酰化受阻导致GABAARα1持续高棕榈酰化，增强了GABA能突触传递并降低CA1神经元兴奋性；GABAARα2表达下调可能是一种对抗过度抑制输入的稳态代偿反应；GluA1表达减少为LTP受损提供了分子解释。行为学上，持续的GABAARα1高棕榈酰化足以诱发学习记忆和社交行为缺陷，提示去棕榈酰化稳态失衡可能是神经精神疾病的潜在机制。研究人员由此提出，PPT1介导的GABAARα1去棕榈酰化通过维持抑制性突触稳态来保障正常的神经元兴奋性、突触可塑性和认知功能。

结论：PPT1通过调控GABAARα1的动态去棕榈酰化来维持受体功能和抑制性突触稳态，这对神经元兴奋性、突触可塑性、学习记忆及社交行为至关重要。这些发现不仅突显了GABAARα1动态棕榈酰化在调节认知功能中的关键作用，还为可逆蛋白棕榈酰化的底物特异性机制及其在神经系统疾病精准治疗策略中的潜在应用提供了新见解。