《Neurobiology of Disease》：CSF1R haploinsufficiency reveals subtle and selective age- and sex-dependent vulnerabilities in cognition and white matter without overt neurodegeneration
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CSF1R单倍剂量不足并不能完全重现成人起病性白质脑病伴轴索球样变和色素性胶质细胞（ALSP）的严重表型。老年雄性小鼠仅在认知需求较高的情况下表现出消退（extinction）和注意力（attention）缺陷。老年雌性小鼠则表现出各向异性分数（FA）降低、神
CSF1R单倍剂量不足并不能完全重现成人起病性白质脑病伴轴索球样变和色素性胶质细胞（ALSP）的严重表型。老年雄性小鼠仅在认知需求较高的情况下表现出消退（extinction）和注意力（attention）缺陷。老年雌性小鼠则表现出各向异性分数（FA）降低、神经突密度指数（NDI）降低以及区域特异性的脂质改变。在缺乏小胶质细胞或少突胶质细胞丢失的情况下，仍出现了细微的脆弱性。生物学性别（biological sex）塑造了CSF1R单倍剂量不足中的脆弱性模式。这些结果与以下模型相容：可能需要额外的因素来驱动疾病进展。
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一、研究背景与科学问题
成人起病性白质脑病伴轴索球样变和色素性胶质细胞（ALSP）是一种罕见的神经退行性疾病，目前缺乏有效治疗手段，全球患病率未知。该疾病以进行性白质变性为主要特征，主要累及额叶、顶叶及胼胝体，同时伴有髓鞘丢失和轴索肿胀（球样变）。临床上，ALSP表现为认知、精神及运动症状的异质性组合，其标志性特征是进行性执行功能障碍，涵盖认知灵活性、决策及冲动控制等方面的缺陷，严重影响患者的独立生活能力和生活质量。由于临床表现广泛且多变，该病常被误诊为阿尔茨海默病或多发性硬化。
多数ALSP病例由集落刺激因子1受体（CSF1R）基因的常染色体显性突变引起，突变主要位于其胞内激酶结构域。CSF1R是一种受体酪氨酸激酶，主要在小胶质细胞中表达，由集落刺激因子1（CSF1）和白介素34（IL-34）激活。CSF1R信号对于小胶质细胞的发育、存活和稳态功能至关重要。此前的研究表明，杂合Csf1r+/?小鼠被提出可作为ALSP的模型，因为单倍剂量不足与年龄依赖性的行为和神经生物学改变相关。然而，CSF1R信号的部分缺失是否足以单独驱动疾病相关的认知表型仍不清楚。现有行为学研究主要集中在物体识别和空间任务上，对执行功能等高阶认知领域的表征不足。此外，大多数研究未将性别作为生物学变量进行分析，也未在衰老过程中评估纵向轨迹。
基于上述背景，研究人员开展了本研究，旨在确定部分CSF1R缺失是否足以产生疾病相关的表型，并系统评估性别和年龄对表型的影响。
二、研究设计与主要结论
研究人员对Csf1r+/?小鼠和野生型（WT）同窝对照进行了纵向评估，采用基于触摸屏的自动化操作平台测试高阶认知功能，包括工作记忆、认知灵活性、注意力和对奖赏与惩罚的敏感性。所有分析均在雄性和雌性小鼠中进行，以解决潜在的性别依赖性效应。研究结合了行为学分析、神经影像学、脂质组学、细胞和分子评估等多维度手段。
研究结果表明，与基于人类严重表型的预期相反，CSF1R信号的部分缺失即使在老年阶段也不会导致广泛的神经退行性变、胶质细胞丢失或全面的认知障碍。相反，CSF1R单倍剂量不足在大脑组织的多个层面上产生了细微的、领域特异性的和性别依赖性的改变。这些结果与以下假设一致：ALSP致病突变可能对CSF1R功能产生显性负效应，而基于缺失的单倍剂量不足模型无法完全重现ALSP患者中突变的结构性后果。该研究的重要意义在于提示，可能还需要额外的因素来驱动疾病进展。
三、关键技术与方法
研究人员使用了多种关键技术方法。在分子层面，采用定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）验证CSF1R在mRNA和蛋白水平的单倍剂量不足。在细胞层面，使用各向同性分馏器方法对后皮层的总细胞数及小胶质细胞（Iba1+）、少突胶质细胞（Olig2+）和神经元（NeuN+）进行定量。在影像学层面，使用9.4特斯拉小动物磁共振系统进行弥散加权成像（DWI），并通过弥散张量成像（DTI）和神经突方向离散度与密度成像（NODDI）模型分析各向异性分数（FA）、平均弥散率（MD）、神经突密度指数（NDI）和方向离散度指数（ODI）。在脂质组学层面，使用基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）分析磷脂酰胆碱（PC）物种的区域分布。在行为学层面，使用Bussey–Saksida触摸屏系统进行成对视觉辨别与逆转（PVD-R）、概率逆转学习（PRL）、试次独一非匹配位置（TUNL）、持续操作任务（CPT）和消退（Extinction）任务测试。研究涉及四个队列：队列1用于PVD-R和PRL测试，队列2用于CPT和Extinction测试，队列3用于TUNL测试，队列4用于MRI成像。所有小鼠均为C57BL/6J背景，实验于2020至2021年间进行。
四、研究结果
4.1 CSF1R单倍剂量不足在mRNA和蛋白水平得到确认，且无代偿性转录变化
qPCR分析证实，Csf1r+/?雄性和雌性小鼠的CSF1R转录本水平均显著降低。相比之下，CSF1、CSF2、IL-34和髓鞘碱性蛋白（MBP）的mRNA水平在两种性别的不同基因型之间均无变化。蛋白质印迹分析进一步证实，Csf1r+/?雄性和雌性小鼠的CSF1R蛋白水平（约140-150 kDa）均显著降低。这些结果表明，CSF1R单倍剂量不足不会在其配体或下游信号标志物中触发代偿性转录变化。
4.2 皮层细胞组成基本保留，但存在性别特异性的神经元数量增加
在24月龄小鼠后皮层中，小胶质细胞和少突胶质细胞数量在两种性别的不同基因型之间均无显著差异。然而，Csf1r+/?雄性小鼠的神经元数量较WT对照组显著增加，而雌性未观察到差异，表明存在性别特异性的神经元数量改变。研究人员指出，所有细胞计数均来源于后皮层，可能无法捕捉其他脑区的小胶质细胞变化。此前研究在更年轻的Csf1r+/?小鼠中报告了白质区域（包括胼胝体脑室上区和 cerebellar 白质）的小胶质细胞密度增加和活化形态，这与ALSP的白质为主病理一致。本研究中后皮层灰质缺乏显著的小胶质细胞变化，与该模型中胶质细胞病理的区域特异性一致。
4.3 弥散MRI揭示皮层和胼胝体中的性别特异性微结构改变
在12-16月龄小鼠中，左侧初级运动皮层内，杂合雄性小鼠的FA和NDI均与WT对照组无差异，而杂合雌性小鼠的FA显著降低，NDI无变化。在胼胝体中，雄性小鼠的FA和NDI均无差异，而杂合雌性小鼠的FA和NDI均显著降低。MD和ODI在两种性别和两个区域中均无显著的基因型相关差异。值得注意的是，杂合雌性小鼠在胼胝体NDI上表现出较WT雌性和两种基因型雄性更低的个体间变异性，提示雌性具有更均匀的微结构表型。
4.4 脂质组学分析揭示磷脂酰胆碱物种的区域特异性改变
研究人员在24月龄雌性Csf1r+/?小鼠中进行了MALDI-MSI分析，共检测到16种磷脂酰胆碱（PC）物种。其中，PC 34:1（m/z 788.6）在初级运动皮层中显著降低，PC 36:2（m/z 824.6）在胼胝体中显著降低。这些发现表明，脂质组成的区域特异性改变与弥散MRI观察到的微结构改变相平行，尤其是在运动皮层和胼胝体中。
4.5 认知灵活性在成年早期表现出性别依赖性的CSF1R单倍剂量不足调节，但随衰老趋于一致
在3-6月龄的成对视觉辨别与逆转（PVD-R）任务中，WT和Csf1r+/?小鼠达到标准的训练次数相似，表明两种性别的视觉辨别学习均完好。逆转学习阶段，两种基因型和性别的表现均随训练次数改善，无基因型主效应或基因型与训练次数的交互作用。在概率逆转学习（PRL）任务中，准确率在所有年龄和基因型之间保持可比，并在14-19月龄时降至接近随机水平。纵向分析显示，在80/20概率条件下，Csf1r+/?雄性在早期/中期成年期与晚期成年期之间出现逆转表现下降，而WT雄性的下降更为温和。在70/30概率条件下，仅观察到温和的年龄相关下降，无显著的基因型依赖效应。雌性方面，WT雌性在80/20和70/30概率条件下均表现出显著的年龄相关逆转表现下降，而Csf1r+/?雌性的表现随年龄变化相对较小。Csf1r+/?雌性年龄相关下降的减弱反映了其较低的初始表现水平，而非认知灵活性的保留。
4.6 工作记忆和模式分离在Csf1r+/?小鼠中保留
在13-16月龄的试次独一非匹配位置（TUNL）任务中，两种性别均表现出分离依赖性表现，较小的空间分离导致准确率降低。在雄性中，这一效应主要由WT小鼠驱动，而Csf1r+/?雄性未表现出显著的分离依赖性差异。在雌性中，两种基因型均表现出稳健的分离效应。在固定延迟（2秒和4秒）的混合分离试验中，两种性别在任何分离水平或延迟条件下均未检测到基因型差异。这些结果表明，工作记忆和模式分离在雄性和雌性Csf1r+/?小鼠中均保留，认知缺陷并非跨领域普遍存在。
4.7 选择性注意力在衰老过程中保留，且受CSF1R单倍剂量不足影响极小
在持续操作任务（CPT）中，缩短刺激持续时间（SD）稳健地损害了所有年龄段小鼠的表现，表现为命中率（HR）和辨别灵敏度（d′）降低，假警报率（FAR）增加。这些效应在不同基因型之间保持一致，SD与基因型的交互作用大多不存在。唯一的例外出现在20-23月龄，Csf1r+/?雄性在最短SD（0.2秒）条件下表现出假警报率的适度增加，提示在最大注意力负荷下错误反应增加。该效应在雌性或更早年龄中未观察到。
4.8 消退学习揭示老年Csf1r+/?小鼠中细微的性别特异性效应
在24月龄的消退任务中，WT和Csf1r+/?小鼠均表现出跨训练次数的进行性反应降低，表明整体消退学习完好。然而，Csf1r+/?雄性在最后一个训练次数中表现出反应增加，提示在消退后期行为更持久。雌性中未观察到基因型差异。研究人员指出，该基因型效应仅见于最后一个消退训练次数，在更早时间点未观察到，因此应谨慎解读为一般的消退学习障碍。
五、讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出，CSF1R单倍剂量不足在分子水平上表现为受体表达稳健降低，但无配体代偿性变化或炎症信号诱导，表明小胶质细胞在受体表达降低的情况下仍保持大致稳态，这与基于阈值的模型一致，即残余的CSF1R活性足以维持基线功能。细胞水平上，未检测到小胶质细胞或少突胶质细胞的丢失，与先前关于CSF1R缺陷模型中胶质细胞增生或密度改变的报告形成对比，提示胶质细胞反应是动态的，受年龄、脑区和环境因素调节。性别特异性的神经元数量增加可能与受损的小胶质细胞依赖性突触修剪有关。
研究结论表明，CSF1R单倍剂量不足本身不足以驱动ALSP的全面病理和临床特征。部分CSF1R信号缺失产生的是细微的、领域特异性的和性别依赖性的改变，而非广泛的神经退行性变或认知障碍。这些结果支持以下模型：ALSP的疾病进展可能需要额外的因素来驱动，而ALSP致病突变可能通过显性负效应发挥作用，这需要通过携带患者特异性错义变异的敲入模型进行直接实验验证。
