基于发光法分析人肝细胞癌球体能量代谢的研究

《Methods》：A luminescence-based assay for analyzing energy metabolism in human hepatocellular carcinoma spheroids

癌细胞即使在氧气充足的情况下也常表现出增强的糖酵解，这一现象被称为瓦博格效应（Warburg effect），是一个潜在的治疗靶点。三维（3D）细胞培养系统可模拟肿瘤团块，但尚不清楚在3D条件下培养的癌细胞是否仍保留这种糖酵解依赖性。本研究采用间接方法，利用靶向糖酵解和线粒体三磷酸腺苷（ATP）合成的小分子抑制剂检测代谢通路依赖性的变化，并在肝细胞癌细胞系中考察了一种新兴抗肿瘤代谢药物——二甲双胍（metformin）的作用。将人肝细胞癌G2（HepG2）细胞培养成半球形聚集体。在二甲双胍预处理后，分别施加靶向糖酵解、三羧酸循环和线粒体ATP合成的小分子抑制剂。经二甲双胍处理后，二维（2D）单层细胞中的ATP水平显著降低，而3D半球形聚集体中的ATP水平未发生变化。加入小分子抑制剂后，与溶剂对照组相比，HepG2单层细胞和半球形聚集体的葡萄糖依赖性均保持不变。此外，抑制线粒体ATP合酶并未显著降低3D构型下的ATP水平。总体而言，HepG2半球形聚集体细胞的ATP产生仍依赖于葡萄糖，但对二甲双胍的ATP反应减弱。因此，考虑到与2D单层细胞不同的代谢反应，使用3D球体测试抗瓦博格效应药物时需要谨慎解读实验结果。需要进一步的直接通量分析来评估代谢通路依赖性。

基于发光法分析人肝细胞癌球体能量代谢的研究解读

一、研究背景与研究目的

在大多数真核细胞中，线粒体是通过氧化磷酸化生成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，这是一个依赖氧的过程。真核细胞也能在细胞质中通过糖酵解分解葡萄糖，在不需氧的条件下产生ATP。Otto Warburg首次描述了癌细胞ATP产生的独特葡萄糖依赖性，观察到即使在氧气充足的条件下，癌细胞也主要利用糖酵解。这种从线粒体依赖性途径向有氧糖酵解的转变被称为瓦博格效应（Warburg effect）。尽管氧化磷酸化比糖酵解更高效地产生ATP，但糖酵解能更快地生成ATP，从而支持癌细胞的增殖和其他代谢过程。

基于瓦博格效应，癌细胞的糖酵解偏好已成为治疗靶点。然而，目前关于瓦博格效应的认知大多来源于人类癌细胞系的二维（2D）培养体系。近年来，三维（3D）细胞培养平台作为研究肿瘤形成、维持和进展以及药物反应的更有价值的工具逐渐兴起。与传统的2D细胞培养相比，癌症球体呈现出更接近肿瘤的微环境，包括细胞间相互作用、缺氧核心以及能量来源和气体的梯度暴露。因此，癌症球体能在更接近肿瘤团块的背景下进行药物测试，其抑制剂量更接近治疗水平，并能模拟耐药性。

肝癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管有多种肝细胞癌细胞系可用，但开发针对肝癌的瓦博格效应靶向药物仍然充满挑战。其中，HepG2细胞的2D培养是最广泛用于测试肝毒性和抗癌药物的平台之一。研究表明，与2D培养相比，HepG2球体的代谢活性有所增加，包括细胞色素P450活性、白蛋白分泌以及代谢相关基因的表达增强。筛选靶向瓦博格效应的抗癌药物通常需要复杂的程序和设备，这严重阻碍了评估葡萄糖依赖性抑制的高通量筛选。近期一项研究使用了靶向能量代谢途径的小分子抑制剂，结合ATP测量，来评估常规2D培养中HepG2细胞的葡萄糖依赖性。尽管3D培养被认为更具生理相关性，但HepG2球体中ATP合成途径的变化仍未得到探索。

本研究旨在比较在2D和3D构型下培养的HepG2细胞系中参与ATP产生的分子途径。为了展示能量代谢的变化，研究人员首先用临床批准的一线口服2型糖尿病药物二甲双胍（metformin）处理HepG2细胞以抑制ATP合成。随后，应用靶向非线粒体依赖性的糖酵解和线粒体依赖性途径（三羧酸循环和电子传递链）的小分子抑制剂来评估能量代谢的变化。值得注意的是，本研究展示了使用基于小分子的方法与ATP发光法作为能量代谢途径依赖性的替代指标，而非直接测量。

二、主要关键技术方法

1. 1.
   3D球体形成技术：使用U型超低吸附96孔板，通过在培养基中添加0.05%甲基纤维素（methylcellulose）提高粘度，使HepG2细胞形成紧凑的半球形聚集体（hemispheroids）。
2. 2.
   ATP发光检测：使用CellTiter-Glo 3D细胞活力测定试剂盒测量细胞内ATP水平，以发光强度（任意单位）表示。
3. 3.
   细胞活力测定：使用CCK-8试剂盒，基于细胞内脱氢酶活性测量细胞活力。
4. 4.
   能量代谢依赖性评估：基于先前报道的方法，使用公式计算葡萄糖依赖性、脂肪酸氧化（FAO）和氨基酸氧化（AAO）能力、线粒体依赖性以及糖酵解能力。

三、研究结果

3.1 3D培养中HepG2细胞的形态和细胞活力

研究目标是生成具有致密团块、中心暗区和半透明周边区的肿瘤样结构。初始尝试使用常规培养基未能形成紧凑的球形。添加0.05%和0.5%甲基纤维素后，HepG2细胞形成了半球形聚集体。0.05%甲基纤维素组边缘清晰，0.5%组则更小更紧凑，中心暗区扩大。所有条件下的ATP水平无差异，但在培养96小时后ATP水平下降。因此，后续实验选择含0.05%甲基纤维素的培养基和24小时孵育时间。

3.2 二甲双胍对2D和3D培养中HepG2细胞活力的影响

在2D细胞培养中，2.5 mM二甲双胍处理48小时后显著降低了标准化ATP细胞活力至30.18%。而在3D半球形聚集体中，二甲双胍处理后标准化ATP细胞活力未见变化。在所有三次独立实验中均观察到此趋势。

3.3 单独代谢抑制剂对2D和3D培养中HepG2细胞活力的影响

在2D培养中，糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）将标准化ATP细胞活力降低近一半至47.27%，线粒体ATP合酶抑制剂寡霉素A（OA）使其降低约25.74%，两者联合（DGOA）则显著降至11.15%。在3D半球形聚集体中，2-DG将标准化ATP细胞活力降至45.59%，但OA无效果，DGOA降至25.01%，比2D单层细胞高出2.24倍。

3.4 二甲双胍与代谢抑制剂的序贯处理

在2D培养中，二甲双胍序贯2-DG处理将细胞活力降至17.57%，序贯OA处理无效果（108.48%），序贯DGOA降至11.63%。在3D半球形聚集体中，趋势相似但有细微差异：二甲双胍序贯2-DG后的标准化ATP细胞活力为24.77%，比2D高1.4倍；OA仍无效果（125.55%）；序贯DGOA降至19.4%，与序贯2-DG水平相当。

3.5 二甲双胍处理的HepG2半球形聚集体的能量代谢依赖性

二甲双胍处理后，2D培养中HepG2细胞的葡萄糖依赖性增加了31.7%，3D半球形聚集体中增加了17.42%，均未达到统计学显著性。两组的FAO和AAO能力均趋于下降超过一半。线粒体依赖性在2D和3D培养中均显著降低，相应地，糖酵解能力在两体系中均有所增加。

四、讨论与结论

本研究表明，人肝细胞癌HepG2细胞在2D和3D培养条件下均依赖有氧糖酵解（瓦博格效应）产生ATP。然而，3D癌症球体更真实地再现了肿瘤微环境中的氧气和营养物质梯度。研究发现，在2D单层和3D半球形聚集体中，2-DG暴露均显著降低ATP水平，而OA处理不影响ATP水平，表明葡萄糖依赖性代谢对维持细胞ATP水平至关重要。

值得注意的是，二甲双胍在2D培养中显著降低ATP水平，但在3D半球形聚集体中无效，这可能与3D球体限制药物渗透有关。实验证据表明，在球体形成后添加二甲双胍（更接近肿瘤团块的药物暴露条件）的效果低于在形成前添加，暗示球体可能限制了二甲双胍的可及性。

研究人员强调，本研究中使用细胞内ATP水平作为代谢途径依赖性的间接测量指标存在局限性，因为ATP水平反映了产生和消耗之间的平衡。小分子抑制剂也可能改变ATP消耗过程。因此，计算的代谢依赖性参数应谨慎解读，它们并不直接代表途径特异性的ATP产生通量。

研究结论：总体而言，HepG2半球形聚集体细胞的ATP产生仍依赖于葡萄糖，但对二甲双胍的ATP反应减弱。因此，考虑到与2D单层细胞不同的代谢反应，使用3D球体测试抗瓦博格效应药物时需要谨慎解读实验结果。需要进一步的直接通量分析来评估代谢通路依赖性。