线粒体Calpain-1切割MAVS调控脑缺血/再灌注损伤中的炎症

《Mitochondrion》：Mitochondrial calpain-1 cleaves MAVS and controls inflammation in cerebral ischemia/reperfusion injury

　　

研究人员利用GPS-CCD软件包探索了新的calpain-1底物。calpain抑制剂可防止线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS）的切割。calpain-1敲除小鼠在脑缺血/再灌注损伤中抑制了MAVS切割。MAVS是calpain-1的一种新底物。MAVS切割可能有助于抑制炎症。

论文解读：线粒体calpain-1切割MAVS调控脑缺血/再灌注损伤炎症

钙蛋白酶（calpain）是一类依赖钙离子激活的半胱氨酸蛋白酶，通过切割底物蛋白参与细胞死亡、代谢和细胞骨架重塑等生理过程。calpain-1在脑、心、肝等多种器官中表达，正常定位于细胞质，但也存在于线粒体膜间隙和基质中。脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤可激活线粒体calpain-1，但其在脑内的精确底物和功能仍不明确。目前已鉴定的线粒体calpain-1底物仅包括ATP5A1、ATP5B、PDH、NCX1、NDUFS7、OPA1和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor, AIF）等少数蛋白。识别新的线粒体calpain-1底物，将有助于理解其在不同疾病病理中的具体作用。

为此，研究人员首先利用GPS-CCD软件包从1160个小鼠线粒体蛋白中预测出30个calpain-1候选底物，再通过体外钙孵育、calpain抑制剂处理、calpain-1基因敲除小鼠及脑I/R损伤模型进行了筛选和验证，最终确定线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）为calpain-1的新底物。该研究揭示了calpain-1通过切割MAVS调控脑I/R损伤中炎症信号的可能机制，为感染非依赖的细胞应激状态下的炎症调控提供了新视角。

本研究采用的主要关键技术方法包括：使用GPS-CCD软件预测calpain-1底物；通过体外线粒体蛋白钙孵育结合蛋白印迹筛选切割片段；采用calpain抑制剂calpeptin和线粒体calpain-1特异性抑制剂Tat-μCL验证切割特异性；利用CRISPR-Cas9电穿孔技术生成calpain-1敲除（CAPN1-KO）小鼠；建立双侧颈总动脉夹闭15 min再灌注24 h的脑I/R损伤模型（雄性C57BL/6J小鼠，8–11周龄，购自CLEA Japan）；使用casein zymography和calpain活性检测试剂盒评估calpain活性；并运用GPS-CCD、CalpaChopper和CALPCLEAV三种算法预测MAVS切割位点。

结果部分如下：

3.1 使用GPS-CCD鉴定calpain-1候选底物
研究人员将小鼠线粒体蛋白序列输入GPS-CCD，以已知calpain-1底物AIF评分为参考，筛选出30个高得分候选蛋白，其中包括MAVS（得分1.894）。该预测为后续实验筛选提供了方向。

3.2 MAVS是calpain-1的潜在底物
在体外钙孵育条件下，MAVS全长蛋白减少，并出现三个分子量分别约28 kDa、24 kDa和17 kDa的切割片段（片段A、B、C）。泛calpain抑制剂calpeptin可完全保护全长MAVS，而线粒体calpain-1特异性抑制剂Tat-μCL仅选择性抑制片段C的产生，提示MAVS切割至少部分由线粒体calpain-1介导。

3.3 calpain-1缺失保护MAVS免受切割
研究人员通过CRISPR-Cas9生成了携带10碱基缺失的CAPN1-KO小鼠，确认其缺乏calpain-1蛋白表达和酶活性。体外钙处理后，CAPN1-KO线粒体样本中MAVS片段C的水平低于野生型（wild-type, WT）样本，表明calpain-1是产生MAVS片段C所必需的。

3.4 calpain-1在脑I/R损伤中切割MAVS
在脑I/R损伤模型中，线粒体calpain活性较假手术组显著升高。WT小鼠脑内检测到MAVS片段A和B，而CAPN1-KO小鼠仅检测到全长MAVS，未出现切割片段。同时，CAPN1-KO小鼠脑中成熟caspase-1水平增加，提示MAVS切割缺失可能影响炎症通路。

3.5 calpain在MAVS的S253/S254和H389/S390位点具有高切割潜力
三种预测工具（GPS-CCD、CalpaChopper、CALPCLEAV）均一致预测MAVS的S253/S254和H389/S390为calpain切割位点，且这些位点切割后产生的片段分子量与实验观察到的MAVS片段A–C大致对应，提示这两个位点可能是calpain-1切割MAVS的关键位点。

在讨论部分，研究人员指出，calpain-1介导的MAVS切割可能通过使MAVS失功能而抑制炎症。CAPN1-KO小鼠中caspase-1成熟增加支持这一假说。calpeptin能完全抑制MAVS切割而Tat-μCL仅抑制片段C，说明除线粒体calpain-1外，其他蛋白酶也可能参与MAVS的部分切割。体内实验中仅观察到片段A和B而未检测到片段C，可能与线粒体提取过程中结构破坏有关。其他线粒体calpain亚型（如calpain-2、-5、-13）也可能切割MAVS，但calpain-1在脑I/R损伤中MAVS降解中起关键作用。此外，由于MAVS在抗病毒信号中发挥核心作用，calpain-1对MAVS的切割也可能影响病毒感染相关病理。预测位点S253/S254和H389/S390仍需实验验证，且样本提取过程中蛋白酶抑制剂的使用可能影响体外片段水平。研究结论可翻译为：总之，研究人员使用GPS-CCD筛选calpain-1底物，鉴定并评估MAVS为候选底物。MAVS在体外钙处理后和体内I/R损伤中被切割。calpain-1抑制剂calpeptin和Tat-μCL可阻止体外MAVS切割，CAPN1-KO小鼠样本也表现切割受抑制，表明MAVS是新的calpain-1底物。因此，这些结果为MAVS介导的炎症通路提供了新见解。