EnvZ/OmpR双拮抗调控轴控制Phytobacter diazotrophicus生物膜介导的β-内酰胺耐受与OmpF依赖性耐药

《Frontiers in Microbiology》：Dual opposing regulatory axes of EnvZ/OmpR control biofilm-mediated tolerance and OmpF-dependent resistance to β-lactams in Phytobacter diazotrophicus

　　

背景：Phytobacter diazotrophicus (P. diazotrophicus)是一种罕见的机会性病原体。其生物膜形成潜力以及EnvZ/OmpR双组分系统将生物膜形成与β-内酰胺类耐药相联系的调控功能尚待阐明。在此，研究人员确认了P. diazotrophicus的生物膜产生，并构建了envZ/ompR敲除突变体，以解析该双组分系统的双重调控作用。方法：本研究通过直接目视观察、革兰染色、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）和浊度测量对生物膜形成进行定性和定量评估。采用MH琼脂平板稀释法测定了12种β-内酰胺类抗生素的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations, MICs）。通过同源重组构建基因缺失菌株。采用定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）和电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assays, EMSA）探讨EnvZ/OmpR系统的调控机制。此外，采用泳动性试验表征生物膜相关的运动表型，并利用溴化乙锭（ethidium bromide, EB）累积试验评估细菌外膜通透性。结果：P. diazotrophicus在BHI培养基中培养时，可在气-液-固界面形成覆盖玻片上的强生物膜，而在LB培养基中则无生物膜形成。与浮游菌相比，生物膜内细菌对哌拉西林、羧苄西林和美罗培南的MICs显著升高，表明生物膜基质赋予这三种β-内酰胺类抗生素特异性耐受。与野生型相比，envZ或ompR缺失完全消除了生物膜形成。qPCR检测证实ΔompR突变体中csgD和fliC的转录显著下调。EMSA进一步证明OmpR直接与fliC和csgD的启动子相互作用。与此调控模式一致，fliC缺失严重损害了细菌的泳动能力，而泳动能力对生物膜组装至关重要。与生物膜相关的耐受表型相反，ΔenvZ和ΔompR突变体对另外8种β-内酰胺类药物的耐药性增强。ΔenvZ和ΔompR突变体对头孢噻肟的MICs分别增加了2倍和4倍。它们对头孢噻吩、头孢西丁、头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南和厄他培南的MICs分别增加了4、4、2、2、4、4和2倍。转录组学分析显示，ompR缺失后，四个外膜孔道蛋白基因（ompF、ompC、ompF₂、phoE）显著下调。单基因敲除验证表明，仅ΔompF突变体对上述8种抗生素表现出升高的MICs（分别升高4、8、4、16、4、2、8和8倍）；缺失ompC、ompF₂或phoE的突变体抗菌药物耐药性无变化。进一步的EMSA结果验证了OmpR与ompF启动子区的直接结合。EB累积试验显示，与野生型相比，ΔompF突变体的荧光强度显著降低，证实OmpF控制外膜通透性。结论：本研究揭示了EnvZ/OmpR系统在临床P. diazotrophicus中调节β-内酰胺耐药性的双重拮抗调控机制。EnvZ/OmpR通过csgD-fliC轴促进生物膜形成，增强对三种特定β-内酰胺类药物的耐受性，同时上调ompF以维持外膜通透性，使细菌对另外8种抗生素敏感。本研究首次揭示OmpR直接调控fliC表达。这些发现阐明了异质性β-内酰胺敏感性的分子基础，并为该罕见病原体的临床感染控制提供了新见解。

研究背景方面，Phytobacter diazotrophicus（P. diazotrophicus）属于肠杆菌科革兰阴性杆菌，近年被报道为临床机会性病原体，且常因被误鉴定为其他肠杆菌科菌种而使其临床意义被低估。β-内酰胺类抗生素是治疗该类感染的重要药物，但多重耐药‘超级细菌’的出现已给临床治疗带来挑战。据美国国立卫生研究院统计，约65%的微生物感染和80%的慢性感染与细菌生物膜有关，生物膜内深埋的细菌难以被抗生素清除，导致慢性感染反复发作、难以控制。在多种细菌中，EnvZ/OmpR双组分系统已被证实参与生物膜形成及外膜孔道蛋白表达的调控，但在P. diazotrophicus中，其生物膜形成能力与EnvZ/OmpR系统如何同时影响生物膜和β-内酰胺耐药性，此前尚不清楚。为此，研究人员以临床分离株P. diazotrophicus Pd1为对象，系统解析了EnvZ/OmpR在该菌中的双重调控作用。

研究人员首先确认P. diazotrophicus可在特定条件下形成生物膜，并构建envZ、ompR敲除突变体及回补菌株，结合转录组测序、qRT-PCR、EMSA、泳动性试验和EB累积试验，揭示了EnvZ/OmpR系统通过两条功能拮抗的调控轴差异化影响β-内酰胺类抗生素敏感性：一方面通过csgD-fliC轴促进生物膜形成，增强对哌拉西林、羧苄西林和美罗培南的特异性耐受；另一方面通过上调ompF维持外膜通透性，降低对另外8种β-内酰胺类抗生素的耐药性。该研究首次发现OmpR直接调控fliC表达，为理解该罕见病原体的异质性β-内酰胺敏感性提供了分子基础，也对临床感染控制具有重要指导意义。

主要关键技术方法如下：研究人员使用临床分离株P. diazotrophicus Pd1（实验室保存）。采用直接观察、革兰染色、扫描电子显微镜（SEM）和浊度测量评价生物膜形成；以MH琼脂平板稀释法测定12种β-内酰胺类抗生素的最低抑菌浓度（MICs）；通过同源重组构建envZ、ompR、csgD、fliC、ompF、ompC、ompF₂、phoE基因缺失突变体及envZ回补菌株；利用转录组测序分析基因表达差异，并用qRT-PCR验证；通过EMSA检测OmpR与靶启动子结合；采用泳动性试验评估鞭毛介导的运动性；以EB累积试验评估外膜通透性。

研究结果如下：

**Phytobacter diazotrophicus在BHI中可在玻片气-液-固界面形成生物膜**：研究人员通过结晶紫半定量试验发现P. diazotrophicus Pd1在聚苯乙烯板上不形成生物膜，但将盖玻片置于BHI液体培养基中静态培养24 h和48 h后，在气-液-固界面形成了肉眼可见的厚生物膜，而LB培养基中未见该现象；革兰染色显示细菌聚集成团，SEM显示这些条带形成致密的团簇结构，符合生物膜特征。进一步通过MIC测定发现，与浮游菌相比，生物膜相关细胞对哌拉西林、羧苄西林和美罗培南的MICs显著升高，而对其他9种β-内酰胺无明显差异，表明生物膜赋予对这三种抗生素的特异性耐受。

**EnvZ/OmpR系统通过正向直接调控csgD和fliC增强生物膜形成**：与野生型相比，ΔenvZ和ΔompR突变体在24 h和48 h时均完全丧失在玻片气-液-固界面形成生物膜的能力，而envZ回补菌株恢复了生物膜形成。转录组测序及qRT-PCR验证显示，ΔompR中fliC和csgD的mRNA表达显著下调；EMSA证明OmpR可直接结合fliC和csgD的启动子区域。进一步构建ΔcsgD和ΔfliC突变体，二者生物膜形成同样受损；泳动性试验显示ΔfliC突变体泳动能力较野生型显著降低，说明fliC通过增强细菌泳动性而促进生物膜组装。因此，EnvZ/OmpR通过直接正调控csgD和fliC促进生物膜形成。

**EnvZ/OmpR系统介导抗生素耐药性**：抗生素敏感性试验显示，与野生型相比，ΔenvZ和ΔompR对头孢噻肟的MICs分别升高2倍和4倍，对头孢噻吩、头孢西丁、头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南和厄他培南的MICs分别升高4、4、2、2、4、4和2倍；envZ回补菌株对上述8种抗生素的MICs恢复至野生型水平。这些结果表明EnvZ/OmpR系统降低了P. diazotrophicus对一组β-内酰胺类抗生素的耐药性。

**EnvZ/OmpR系统通过上调ompF表达增加通透性，从而降低抗生素耐药性**：转录组分析显示，ΔompR中四个外膜孔道蛋白基因ompF、ompC、ompF₂和phoE均显著下调。单基因敲除验证表明，仅ΔompF突变体对上述8种β-内酰胺类抗生素的MICs显著升高（分别升高4、8、4、16、4、2、8和8倍），而ΔompC、ΔompF₂和ΔphoE突变体的耐药性无变化。EMSA进一步证明OmpR可直接结合ompF启动子区域。EB累积试验显示ΔompF突变体的荧光强度较野生型显著降低，说明OmpF缺失导致外膜通透性下降，从而减少了抗生素的胞内累积。因此，EnvZ/OmpR通过上调ompF增强外膜通透性，从而降低菌株对多种β-内酰胺类抗生素的耐药性。

在讨论部分，研究人员指出，本研究首次证实临床来源的P. diazotrophicus可在BHI培养基中于气-液-固界面形成生物膜，该表型具有菌株特异性和营养依赖性，与以往在环境分离株中的观察不同。关于OmpR对csgD的调控，与沙门氏菌中OmpR及磷酸化OmpR-P的复杂调节不同，本研究中未磷酸化的OmpR可直接结合并上调csgD；但未进行报告基因检测，磷酸化OmpR是否在特定条件下具有抑制作用仍需进一步验证。此外，OmpR直接调控fliC且不依赖flhDC通路，是本研究首次报道的新机制。外膜孔道蛋白方面，仅ompF缺失导致耐药性增加，与粘质沙雷氏菌中的现象一致；ompF₂虽也受EnvZ/OmpR直接调控，但其致病作用及详细机制尚待研究。最后，生物膜的保护作用仅对特定β-内酰胺类抗生素有效，可能与不同β-内酰胺靶向的青霉素结合蛋白在不同生长状态下的活性差异有关；imipenem不受两种机制影响，可能源于其独特的跨膜转运特性。

研究结论部分可翻译为：本研究首次证实P. diazotrophicus能在BHI液体培养基中的盖玻片气-液-固界面形成生物膜。与浮游菌相比，生物膜相关细胞对哌拉西林、羧苄西林和美罗培南表现出显著增强的耐受性。EnvZ/OmpR双组分系统通过正向激活csgD和fliC的表达促进生物膜形成，其中OmpR直接调控fliC表达为首次发现。具体而言，fliC增强细菌泳动性以促进生物膜组装，这也特异性地提高了菌株对上述三种抗生素的耐受性。与此同时，EnvZ/OmpR信号级联上调ompF表达并增强细菌外膜通透性，使菌株对大多数β-内酰胺类抗生素更为敏感。总之，EnvZ/OmpR系统通过两条功能拮抗的途径差异化调节细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性：一方面，通过诱导生物膜形成特异性地增加对哌拉西林、羧苄西林和美罗培南的耐受；另一方面，通过上调OmpF孔道蛋白并增强外膜通透性，降低对大多数其他β-内酰胺类抗生素的耐药性。