基于Bacillus subtilis一步微生物转化废糖蜜制备生物活性类黄腐酸肥料：土壤质量提升与农业废弃物资源化的可持续策略

《Frontiers in Microbiology》：One-step microbial conversion of waste molasses into bioactive fulvic-like acid fertilizer for sustainable soil quality improvement and agricultural waste valorization

　　

废糖蜜（waste molasses，WM）是制糖工业中碳含量丰富的副产物，常未被充分利用，导致环境污染和资源损失。研究人员开发了利用Bacillus subtilis的一步微生物生物转化工艺，将WM转化为糖蜜源黄腐酸（molasses-derived fulvic acid，MFA）。在35 °C、48 h和5%接种率条件下，MFA最高产量（33.54%）得以实现。整合GC-MS和LC-MS分析揭示了发酵过程中底物的动态转化，并提示4-羟基-2-甲基苯乙酮（4-hydroxy-2-methylacetophenone）、4-氧代十二烷二酸（4-oxododecanedioic acid）和3-羟基-2-辛基戊二酸（3-hydroxy-2-octylpentanedioic acid）是参与MFA形成的假定中间体。结构表征显示所得MFA具有疏松多孔形态，并富含羟基、羧基和羰基。在一项为期150 d的田间试验中，与未施肥对照相比，MFA施用与更高的土壤有机碳（soil organic carbon，SOC）和腐殖质含量相关，并促进玉米营养生长。MFA还富集了包括Pseudomonas、Acidobacterium、Actinobacteria和Bacteroidetes在内的微生物群落。与碳同化和羧化相关的若干基因丰度亦增加，包括rbcL、rbcS、accB、accC和pccA。代谢组学分析进一步揭示与中心碳代谢途径（包括糖酵解和戊糖磷酸途径）相关代谢物的变化。MFA施用还在无化学肥料输入下显著促进玉米生长，表明其作为有机土壤改良剂和部分肥料替代品的潜力。总体而言，这些发现表明一步微生物转化可将WM转化为功能性类黄腐酸肥料。该方法为矿物源FA生产提供了潜在途径，同时结合农业废弃物再利用、土壤质量改善、部分肥料依赖降低和循环农业发展。

研究背景与问题：集约化农业扩张提高了全球粮食产量，但也加速土壤退化、有机质耗竭和养分失衡，威胁长期农业可持续性。黄腐酸（fulvic acid，FA；腐殖质中生物活性较高、分子量较低且含氧官能团丰富的组分）因可改善土壤团聚体、养分有效性、微生物活性和植物生长而受到关注。然而，商业FA生产仍主要依赖褐煤和风化煤碱提；原文指出KOH和NaOH提取褐煤的FA产率分别为26.34%和24.56%，但存在化学品消耗高、碱废水二次污染、产品质量不稳定和化石碳不可逆消耗等问题。微生物转化可在温和条件下通过酶促氧化、解聚、缩合和聚合将低值有机底物转化为腐殖样物质，具有低能耗、少化学输入和环境兼容等优势。WM是糖业重要副产物，富含碳水化合物、有机碳和微量元素；未处理排放会加重环境污染。现有WM利用多为饲料加工、生物炼制和生化制备，但存在流程长、能耗高、成本高及副产物处理不足等问题。WM含氨基酸、维生素和无机离子，适合微生物发酵；已有研究表明葡萄糖可水解为糠醛和5-羟甲基糠醛，再水合形成甲酸、乙酸等小分子酸，构成FA合成前体。以往微生物或水热途径多关注木质纤维素固体残渣，依赖水热预处理、堆肥或多步物理化学生物过程；直接微生物转化WM为FA富集产品、系统追踪底物转化并进行田间尺度土壤生态响应评价尚未充分探索。

研究开展、结论与意义：该研究建立Bacillus subtilis一步微生物转化WM为MFA的工艺，优化发酵条件以提高转化效率，采用GC-MS、LC-MS和多种光谱技术阐明MFA形成中的底物转化和结构演化；进一步通过田间试验整合土壤理化分析、微生物群落分析、功能基因定量和代谢组学，评价MFA对土壤质量和碳代谢的影响。结果表明，MFA最高产率达33.54%；所得MFA疏松多孔并富含含氧官能团；田间施用与SOC和腐殖质含量提高、玉米营养生长改善、特定微生物类群富集、碳同化/羧化相关基因丰度增加及中心碳代谢相关代谢物变化相关。该研究为WM微生物增值和矿物源FA替代生产提供了潜在路径，并耦合农业废弃物循环、生物活性肥料生产、土壤质量改善和部分肥料依赖降低。

关键方法（≤250字）：以MFA产量为响应值，先单因素考察温度、时间、接种量，再用Box-Behnken响应面法（response surface methodology，RSM）优化；25 L可控玻璃发酵罐，WM初始20%（v/v），200 rpm、1.0 VVM、pH 7.2。采用SEM、FTIR、¹³C NMR、XPS和元素分析表征；GC-MS与LC-MS定性/半定量发酵液。田间随机区组150 d玉米试验设CK、CN（15-15-15，600 kg/hm²）和CF（0.2% MFA基施，w/w干土20 cm）；宏基因组测序结合KEGG/eggNOG/CAZy注释和MetaGenomeSeq差异分析；非靶向LC-MS/MS代谢组学结合PCA/PLS-DA与KEGG分析。样本来源：WM采自中国广西糖厂制糖后残糖蜜（碳320 g/kg、氮16.4 g/kg）；菌株CICC 10148；田间试验在吉林农业大学试验田，5年未施肥未种植（有机质11.5 g/kg、氮0.44 g/kg）。

研究结果：
3.1 一步微生物生物转化生产MFA的优化：通过单因素和RSM研究温度、时间、接种量及其交互作用，发现MFA产量随温度升至35 °C而增加、继续升至45 °C下降；48 h前快速增加、延长发酵后下降；接种率增至5%促进生产、过高则下降。椭圆等高线显示三变量交互显著；在35 °C、48 h、5%接种率下MFA最高产量33.54%，接近模型预测，表明MFA形成受多参数耦合控制而非单一因素决定。
3.2 WM发酵过程中酶介导的底物转化：通过漆酶和转化酶活性及GC-MS/LC-MS分析，发现漆酶活性先升后降，24 h为40.08 U/L、48 h升至106.52 U/L、60 h降至87.64 U/L；转化酶呈相似趋势，24 h为3.23 U/mL、48 h为8.91 U/mL、60 h为5.06 U/mL。GC-MS/LC-MS显示WM中主要挥发物、有机酸、酚类、脂质和氨基酸持续下降，4-羟基-2-甲基苯乙酮、4-氧代十二烷二酸和3-羟基-2-辛基戊二酸先瞬时积累后下降，提示其为MFA形成相关假定中间体；这些物质最终经氧化、缩合和聚合形成含羧基、羟基和甲氧基等活性官能团的MFA。
3.3 MFA结构特征：通过SEM、FTIR、¹³C NMR、XPS和元素分析，发现MFA呈疏松多孔形态；FTIR显示–OH、C=O、–COOH及芳香醚/脂肪族C–O相关吸收；NMR显示较强烷基碳和羰基碳信号、较弱相邻烷基碳信号，未检出甲氧基碳和芳香碳特征信号，说明产物以脂肪族、氧富集为主，未发生广泛芳构化或高度缩合芳香大分子形成。XPS显示C1s和O1s峰及C–C、C–O、O–C=O等组分；元素分析为C 32.61%、H 4.40%、O 30.58%、N 1.21%，H/C约1.61、O/C约0.70、C/N约31.4，支持高氧化度、脂肪族特征和低氮含量。
3.4 MFA对SOC和腐殖质积累的影响：通过150 d田间CK、CN和CF比较，CK的SOC由30 d的12.81 g/kg降至120 d的10.5 g/kg、150 d回升至11.24 g/kg；CN由15.24 g/kg降至12.39 g/kg、150 d为14.93 g/kg，较CK提高32.83%；CF由17.55 g/kg降至13.76 g/kg、150 d为15.27 g/kg，较CK提高35.85%、较CN提高2.28%。150 d时HS含量CK为8.64 g/kg、CN为9.35 g/kg（较CK提高8.22%）、CF为11.17 g/kg（较CK提高29.28%、较CN提高19.47%）。结果表明MFA可直接补充有机碳、促进微生物活性、增强土壤保碳能力并加速腐殖化。
3.5 土壤微生物群落重组与代谢反应：通过宏基因组PCA、类群丰度和功能基因分析，发现CK、CN、CF在PCA中明显分离；CF显著上调Pseudomonas、Acidobacteriota、Actinomycota和Bacteroidota相对丰度，并提高rbcL、rbcS、accB、accC和pccA相对丰度。代谢组PCA显示处理间整体代谢谱分离；CF显著上调D-(+)-Galactosamine、2-(4-hydroxyphenyl)-1-nitroethane、vidarabine和arbutin；KEGG分析显示碳代谢、氮代谢、能量代谢和次级代谢生物合成等途径变化，糖酵解和戊糖磷酸途径中Salicin、Glycerone-P和D-Ribose增强，提示MFA处理与土壤微生物碳代谢转变相关。
3.6 植物生长状况：通过150 d田间玉米生长指标测定，CK株高142.34 cm、茎粗1.16 cm、叶长50.93 cm、地上干物质110.52 g，均为最低；CN分别为248.51 cm、2.63 cm、88.36 cm和284.26 g；CF分别为230.06 cm、2.41 cm、80.18 cm和237.96 g。CF显著优于CK，虽略低于CN但总体差异小、表现相似且无明显生长弱势，表明MFA可改善瘠薄土壤结构、土壤质量和养分供应能力，在无肥料输入下仍促进玉米生长，并可能降低对肥料依赖。

讨论部分总结：原文认为，一步生物转化WM为FA的核心机制在于Bacillus subtilis的酶催化和底物导向重构。WM为复杂底物，以易发酵碳水化合物为主，同时含酚类、有机酸、氨基酸、脂质和无机营养。接种量呈非线性效应：低接种时初始生物量有限，可能延迟微生物增殖、胞外酶积累和底物转化；5%（v/v）可提供足够活性生物量快速启动底物利用和MFA形成；高于5%可能加剧碳氮源竞争和氧需求，在固定搅拌与通气下增加氧传递限制风险，故5%代表初始生物量、养分可利用性和氧供给的平衡。发酵中底物非均匀转化，原生糖蜜组分同时耗竭与低分子量化合物瞬时积累表明碳经多代谢途径动态再分配；乙酰苯酮和二羧酸相关化合物的瞬时积累与候选中间体形成一致，但原文未证明直接前体—产物关系。水解和氧化共同控制转化：转化酶可能通过产生可发酵单糖提高蔗糖碳可及性；漆酶介导氧化可能将易感酚类转化为苯氧自由基或醌样结构，参与偶联、亲核加成、酯化和缩合。MFA富集羟基、羧基、羰基和C–O基团，但NMR弱芳香碳信号不支持广泛芳构化或高度缩合芳香大分子形成，更合理的是氧富集、以脂肪族为主的FA样组合，其农艺活性可能主要来自高氧官能度、分子异质性和化学反应性。从现代腐殖质视角，MFA不一定是单一共价大分子，而更可能是低/中分子量化合物通过氢键、疏水作用、金属桥接、酯键和部分氧化偶联稳定的超分子缔合；微生物发酵并非简单合成MFA，而是将原糖蜜碳重构为化学异质和功能反应性有机组分。施入土壤后，MFA可能通过直接有机碳添加和间接生物转化两条并行机制影响土壤碳动态；易分解组分可作碳能源刺激微生物生长和底物周转，羧基、羟基和羰基丰富组分可与黏土矿物、金属离子和现有有机质通过配体交换、阳离子桥接、氢键和表面络合作用，改变有机底物可及性并可能增加驻留时间；短期微生物代谢与长期碳保持的平衡受矿化、微生物同化、残体形成和矿物结合影响，并可能由微生物碳利用效率介导。原文同时指出，未回收为MFA的部分不应简单视为未转化废物，可能包括未消耗糖、可溶性有机化合物、微生物生物量、低分子量代谢物和其他非MFA有机组分；后续可通过优化底物负载、补料策略、营养平衡、搅拌、通气、溶氧，或采用补料分批避免高初始糖蜜负载带来的渗透胁迫、营养失衡和氧需求；残糖和低分子量化合物可经二次生物转化生产增值代谢物或能量载体，残余有机质可结合厌氧消化、堆肥或其他腐殖化过程生产土壤改良产品，从而由单产品MFA发酵转向综合WM生物炼制。该工作的生物炼制意义在于将废弃物价值化与土壤功能耦合：不是仅将糖蜜作为纯化化学品的发酵原料，而是将异质工业副产物转化为功能复杂改良剂，其价值来自化学性质及重塑土壤生物过程的能力；机制价值不仅在于生产FA肥料，还在于展示微生物转化可将工业糖副产物转化为生物活性材料，耦合废弃物碳再利用与土壤生态修复。局限性包括：未进行比较菌株筛选，不能证明所用菌株为最优；工艺优化仅限温度、时间和接种量，混合、通气、溶氧、氧传递能力、底物负载策略和营养平衡为固定或未测变量；未建立完整碳质量平衡，未回收碳可能留在残余可溶底物、微生物生物量、低分子量代谢物或其他有机产物中，或释放为CO₂；候选中间体未证明直接前体—产物关系，未来需稳定同位素标记结合代谢通量分析追踪碳分配；需改进分离纯化以定义MFA化学组成；菌株改良可通过适应性实验室进化、经典诱变和代谢/合成生物学提高高渗糖浆耐受、碳水化合物吸收利用、氧化和胞外酶能力并重定向胞内碳分配；残留盐、未用糖和低分子量有机酸等酸溶化合物可能贡献回收干物质但未量化，未来需脱盐、透析色谱或分子量分级提高化学定义和纯度评价；田间评价仅限单一150 d玉米生长季，未考察不同气候和土壤条件下MFA降解动态、持久性、养分释放和农艺效应，长期累积效应仍不清楚，未来需多点多多年、跨气候带、土壤类型和种植制度试验。

研究结论（翻译）：该研究成功利用Bacillus subtilis一步发酵法由WM制备FA并实现实际应用。在发酵温度35 °C、时间48 h、接种量5%的最优条件下，MFA产量达33.54%。4-羟基-2-甲基苯乙酮、4-氧代十二烷二酸和3-羟基-2-辛基戊二酸是与MFA形成相关的假定中间体。制备的MFA呈疏松多孔微观结构并富含含氧官能团。在单一150 d田间试验中，与未施肥对照相比，MFA处理在150 d时与SOC含量提高35.85%和腐殖质含量提高29.28%相关，并改善玉米营养生长；还与土壤微生物群落组成变化相关，包括Pseudomonas、Acidobacteriota、Actinomycetota和Bacteroidota相对丰度增加。MFA处理还与rbcL、rbcS、accB、accC和pccA较高丰度相关，表明碳同化和羧化相关遗传潜力富集，而非功能活性增加的直接证据。代谢组学分析进一步揭示与中心碳代谢途径尤其是糖酵解和戊糖磷酸途径相关代谢物丰度改变。该方法通过将废糖蜜转化为MFA型土壤改良剂，为制糖工业副产物增值利用提供了潜在途径；为改善土壤质量、资源回收和减少部分施肥提供了新的有机改良策略。