雷美替胺通过MT1-cAMP轴抑制星形胶质细胞衰老并保护多巴胺能神经元

《Frontiers in Aging Neuroscience》：Ramelteon suppresses astrocytic senescence via MT1-cAMP axis to protect dopaminergic neurons

　　

星形胶质细胞衰老日益被认为是帕金森病（Parkinson’s disease，PD）发病机制的关键因素。雷美替胺（Ramelteon）作为一种获临床批准的MT1/MT2褪黑素受体激动剂，已在多种神经系统疾病中显示出神经保护作用。然而，Ramelteon能否抑制星形胶质细胞衰老及其潜在机制仍不清楚。

方法：研究人员采用体内MPTP诱导的PD小鼠模型评估Ramelteon的治疗潜力；体外采用原代星形胶质细胞长期培养诱导的复制性衰老模型（体外培养40天，days in vitro，DIV）及MPP⁺诱导的早衰模型。通过免疫印迹、实时定量PCR、免疫荧光、SA-β-gal染色和免疫组织化学评估星形胶质细胞衰老、多巴胺能神经元存活及运动功能。

结果：Ramelteon治疗显著减轻了MPTP诱导的黑质致密部（substantia nigra compacta，SNc）多巴胺能神经元丢失，并改善了小鼠运动缺陷。体外实验中，Ramelteon显著抑制了复制性衰老和MPP⁺诱导的星形胶质细胞衰老，表现为p16^Ink4a和SA-β-gal活性降低、LaminB1表达恢复、衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）因子（IL-6、IL-1β、CXCL10和MMP9）减少。机制上，敲低Mtnr1a（编码MT1）而非Mtnr1b（编码MT2）可大部分消除Ramelteon的抗衰老效应。MT1激活抑制腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）活性并降低细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平。值得注意的是，衰老星形胶质细胞表现出cAMP水平升高，cAMP抑制剂SQ22536可模拟而cAMP类似物dbcAMP可逆转Ramelteon的抗衰老效应。此外，Ramelteon通过MT1-cAMP信号减少衰老星形胶质细胞线粒体活性氧（mitochondrial ROS，mitoROS）的产生。

讨论：研究结果表明，Ramelteon通过MT1受体介导的cAMP抑制和线粒体ROS减少来抑制星形胶质细胞衰老，从而在PD小鼠模型中保护DA神经元。本研究确定Ramelteon是PD的潜在治疗药物，其通过激活MT1抑制星形胶质细胞衰老。

**论文解读：雷美替胺经MT1-cAMP轴抑制星形胶质细胞衰老保护多巴胺能神经元**

**1 研究背景与问题**

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是第二大常见神经退行性疾病，以黑质致密部（substantia nigra compacta，SNc）多巴胺能（dopaminergic，DA）神经元进行性丢失为核心病理特征。衰老是PD最重要的危险因素，细胞衰老（cellular senescence，细胞不可逆性增殖停滞状态）被认为是连接衰老与PD发病的关键环节。星形胶质细胞（astrocyte，中枢神经系统数量最多的胶质细胞）在维持神经元代谢与突触功能中发挥重要作用。衰老的星形胶质细胞呈现p16^Ink4a上调、LaminB1下调，并分泌衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）因子（IL-6、IL-1β、CXCL10和MMP9），损害邻近神经元。已有研究在PD患者及模型动物SNc中检测到衰老星形胶质细胞，但靶向星形胶质细胞衰老是否能够保护DA神经元尚缺乏明确证据。

褪黑素受体MT1（由Mtnr1a编码）和MT2（由Mtnr1b编码）是广泛表达于脑内的G蛋白偶联受体。研究人员前期发现PD小鼠SNc中MT1表达显著降低，且MT1缺失可加剧小胶质细胞炎症反应，提示MT1具有神经保护作用。雷美替胺（Ramelteon）是获临床批准的非选择性MT1/MT2激动剂，对MT1的亲和力约为MT2的10倍，可穿透血脑屏障，在多种神经系统疾病模型中表现出神经保护效应。然而，Ramelteon能否抑制星形胶质细胞衰老及其具体分子机制尚未阐明。

**2 研究内容与方法概述**

为回答上述问题，研究人员构建了体内外衰老模型并解析相关机制。体内实验使用44只雄性C57BL/6小鼠（6–8周龄，25–30 g），随机分为4组（n=11/组），以MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶，30 mg/kg/天，腹腔注射7天）诱导PD模型；Ramelteon（20 mg/kg/天）于MPTP注射前7天开始连续给药14天。每组8只小鼠进行行为学测试，其中6只进一步用于TH免疫组化；另设每组3只的小鼠队列用于免疫印迹和实时定量PCR分析。体外实验使用40只新生（P0–3）小鼠皮层制备原代星形胶质细胞，建立40天体外培养（days in vitro，DIV）复制性衰老模型及MPP⁺（500 μM，24 h）诱导的早衰模型，Ramelteon处理浓度为50 μM。主要技术包括免疫印迹、实时定量PCR、免疫荧光、SA-β-gal染色、免疫组织化学、cAMP ELISA、MitoSOX线粒体ROS检测、siRNA敲低以及条件培养基（conditioned medium，CM）转移实验等。

**3 主要研究结果**

**3.1 Ramelteon抑制星形胶质细胞衰老并减轻MPTP诱导的PD小鼠DA神经变性**

在MPTP小鼠模型中，TH免疫组化显示MPTP导致SNc区域TH阳性神经元大量丢失，而Ramelteon预处理显著减轻了这一丢失；旋转杆实验和爬杆实验表明，Ramelteon明显改善了MPTP诱导的运动缺陷。免疫印迹和实时定量PCR分析显示，MPTP诱导的p16^Ink4a上调、LaminB1下调以及IL-6、IL-1β、CXCL10和MMP9等SASP因子mRNA水平的升高均可被Ramelteon显著逆转。

**3.2 Ramelteon抑制体外复制性星形胶质细胞衰老**

与10 DIV年轻星形胶质细胞相比，40 DIV衰老星形胶质细胞呈现SA-β-gal阳性率升高、p16^Ink4a上调、LaminB1下调及SASP因子升高的衰老表型。50 μM Ramelteon处理5天可显著降低SA-β-gal阳性细胞比例，恢复GFAP阳性星形胶质细胞中LaminB1荧光强度，抑制p16^Ink4a蛋白表达，并下调SASP因子mRNA水平。

**3.3 Ramelteon减轻MPP⁺诱导的早衰**

在原代星形胶质细胞中，MPP⁺（500 μM，24 h）处理显著增加SA-β-gal阳性细胞比例、上调p16^Ink4a、下调LaminB1并升高SASP因子表达。Ramelteon（50 μM）预处理2 h可显著逆转上述衰老相关指标，表明Ramelteon可抑制神经毒素诱发的星形胶质细胞早衰。

**3.4 Ramelteon减弱衰老星形胶质细胞的神经毒性**

条件培养基转移实验显示，40 DIV衰老星形胶质细胞或MPP⁺处理星形胶质细胞的条件培养基可显著增加MES23.5 DA能神经元细胞的碘化丙啶（propidium iodide，PI）阳性细胞比例和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放。而经Ramelteon处理的衰老星形胶质细胞条件培养基则显著降低了上述细胞毒性指标，说明Ramelteon能够抑制衰老星形胶质细胞对DA神经元的毒性作用。

**3.5 MT1是Ramelteon抗衰老效应所必需的**

在原代星形胶质细胞中分别转染靶向Mtnr1a或Mtnr1b的siRNA，敲低效率经实时定量PCR确认。在40 DIV复制性衰老模型和MPP⁺早衰模型中，Mtnr1a敲低均可大部分消除Ramelteon对p16^Ink4a和LaminB1的调节作用；而Mtnr1b敲低对Ramelteon的抗衰老效应无显著影响。这证实Ramelteon的抗衰老作用特异性由MT1受体介导。

**3.6 cAMP降低介导Ramelteon的衰老抑制作用**

cAMP含量测定显示，复制性衰老（40 DIV）和MPP⁺处理均可导致星形胶质细胞内cAMP水平升高，Ramelteon则显著逆转该升高。腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）抑制剂SQ22536单独处理可模拟Ramelteon的抗衰老效应，降低p16^Ink4a并恢复LaminB1；而细胞通透性cAMP类似物dbcAMP则可逆转Ramelteon对p16^Ink4a和LaminB1的调节。上述结果表明，抑制异常cAMP升高是Ramelteon抑制星形胶质细胞衰老的关键环节。

**3.7 MT1-cAMP信号调控衰老星形胶质细胞线粒体ROS**

MitoSOX染色和流式细胞术分析显示，复制性衰老和MPP⁺诱导的早衰星形胶质细胞中线粒体ROS（mitochondrial ROS，mitoROS）水平显著升高，Ramelteon和SQ22536均可有效抑制该升高。线粒体靶向抗氧化剂MitoQ处理可模拟Ramelteon的抗衰老效应，显著降低两种衰老模型中的SA-β-gal阳性细胞比例。这些结果说明，MT1-cAMP信号通过减少mitoROS产生来抑制星形胶质细胞衰老。

**4 讨论与结论**

讨论部分指出，MT1在PD中具有多重保护作用，包括调节小胶质细胞代谢和炎症、改善线粒体功能等；cAMP与mitoROS的关系存在细胞类型和病理背景依赖性，在星形胶质细胞衰老模型中cAMP升高与mitoROS增多相关联，而cAMP降低可抑制mitoROS产生。由于睡眠障碍是PD最常见的非运动症状之一，已获批用于失眠治疗的Ramelteon可能兼具改善睡眠节律和拮抗星形胶质细胞衰老的双重获益。MT1受体晶体结构的解析也为开发MT1选择性激动剂提供了结构基础。研究局限性包括分子分析样本量较小、仅使用雄性小鼠、MPTP模型不能完全模拟PD的进行性和多因素病程、未使用星形胶质细胞特异性条件敲除小鼠、Ramelteon并非完全MT1选择性等。

研究结论为：Ramelteon通过激活MT1，经cAMP降低和mitoROS抑制来抑制星形胶质细胞衰老，从而在PD小鼠模型中保护DA神经元。该研究为Ramelteon治疗PD提供了机制依据，并将MT1确立为年龄相关神经退行性疾病的潜在治疗靶点。