《Frontiers in Genetics》：The potential for large-scale genome editing in finfish aquaculture via germline stem cell culture and transplantation
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摘要专业翻译
基因组编辑已成为补充选择性育种计划并加速水产养殖遗传增益的有力工具。尽管基于CRISPR的基因组编辑已在多个具有重要经济价值的鱼类物种中成功应用，但其在产业规模上的推广仍面临挑战，主要原因是现有递送方法的局限性——这些方法主要依赖人工胚胎显微注射
摘要专业翻译
基因组编辑已成为补充选择性育种计划并加速水产养殖遗传增益的有力工具。尽管基于CRISPR的基因组编辑已在多个具有重要经济价值的鱼类物种中成功应用，但其在产业规模上的推广仍面临挑战，主要原因是现有递送方法的局限性——这些方法主要依赖人工胚胎显微注射。该途径劳动密集、技术要求高，且常导致创始个体（founder）出现高水平的嵌合体（mosaicism），需要额外世代繁殖才能建立稳定基因型。在本迷你综述中，研究人员探讨了将生殖系干细胞（germline stem cell, GSC）培养与移植技术相结合，作为进一步改良鱼类基因组编辑的替代平台的潜力。通过在生殖系传递之前实现遗传改变的体外（in vitro）引入、验证与扩增，该方法有望提高可扩展性、减少嵌合体并缩短育种周期。尽管仍存在若干技术挑战，GSC培养与移植方法的持续进展有望推动定制化基因组编辑在实际生产中的应用，从而改善水产养殖中的遗传增益、鱼类健康与福利。
论文主体内容总结
1 引言
水产养殖在全球食品供应中扮演日益重要的角色，但该产业仍面临若干生物学和技术挑战，制约其以可持续且符合鱼类福利的方式满足未来海产品需求。与传统陆生畜牧相比，水产养殖是相对年轻的产业，通过选择性育种对养殖鱼类进行遗传改良具有巨大潜力。然而，部分重要经济鱼类的世代间隔较长，以及多性状联合选育的复杂性，限制了传统育种方案的遗传增益。基因组编辑被提出作为补充手段，可加速精准引入与繁殖与不育、生长、抗病性及鱼类整体健康与福利相关的优良性状。
CRISPR/Cas基因组编辑的发现推动了大西洋鲑、虹鳟、尼罗罗非鱼、鲤鱼和斑点叉尾鲷等多种水产养殖鱼类的功能基因组学研究。然而，尽管取得上述成果，基因组编辑在产业规模上的实施仍面临技术限制和全球不确定的监管与商业环境。目前鱼类体内（in vivo）基因组编辑主要通过人工显微注射至受精卵实现，该过程劳动密集、限制可扩展性。此外，F0创始鱼中嵌合体（mosaicism）高度普遍，需通过繁殖编辑个体以获得携带目标基因突变的品系，对于世代间隔较长的物种而言构成显著瓶颈。
一种潜在的解决方案是通过生殖系干细胞（germline stem cell, GSC）体外（in vitro）培养并移植入不育替代亲本。在细胞培养系统中，遗传编辑可在移植前得到验证，从而绕过多世代繁殖，在单代内直接产生携带目标遗传修饰的配子。本迷你综述以大西洋鲑为重点，评估当前基因组编辑方法的挑战，并讨论稳健的GSC培养系统如何为水产养殖硬骨鱼类产业规模基因组编辑奠定基础。
2 当前鱼类基因组编辑面临的挑战
鱼类基因组编辑主要通过人工显微注射CRISPR/Cas组分至早期发育阶段（优选单细胞期）的受精卵中完成。该递送方法劳动密集且需高技术水平，限制通量与可扩展性。显微注射过程可因机械损伤及试剂潜在毒性导致胚胎/卵死亡率。此外，基因组编辑的F0创始鱼常表现出高度嵌合体（mosaicism），即胚胎在多细胞期被注射和/或编辑缓慢或不完全时，个体中编辑与未编辑（野生型）细胞混合存在。不完全编辑可能源于向导RNA（guide RNA, gRNA）在基因组DNA上产生突变的能力差异，即gRNA效率不同，部分基因组靶位点较其他位点更易编辑。尽管已有多种计算工具预测gRNA效率，其准确性仍不足以防止嵌合结果。同一体内编辑细胞可能携带不同突变类型和频率，包括破坏基因功能的移码突变及保留部分或全部蛋白活性的框内突变，因此F0创始鱼的表型结果通常难以解读。
由于上述限制，基因组编辑的F0创始雄鱼通常与野生型雌鱼杂交，在F1代产生定义的杂合基因型。进一步繁殖至F2代可获得双等位基因突变体。对于世代间隔较长的物种，如大西洋鲑（约3-4年），这显著增加了在亲本群体中验证和实施基因组编辑性状所需时间。另一种策略是F0创始鱼相互杂交，在F1代即产生双等位基因编辑鱼，但部分个体可能携带不同突变变体。
迄今，水产养殖物种的大多数基因组编辑研究集中于基因敲除模型。大西洋鲑中已报道多种敲除模型，靶向繁殖相关基因如dnd1、fshr、bmp15、piwil1和stra8，以及色素沉着、脂肪酸合成或免疫相关基因。这些研究提供了基因功能见解，部分展示了具有育种应用潜力的成果，包括不育鱼生产、单性群体或增强生长性能。例如，生殖细胞缺失的dnd1突变大西洋鲑经完整生产周期表现与野生型相似。未来水产养殖应用可能需要更复杂的遗传修饰，如多重基因敲除甚至敲入。敲入（knock-in）在水产养殖鱼类中仍具挑战性，主要由于同源定向修复（homology-directed repair, HDR）途径频率远低于竞争性的非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）途径。尽管如此，已有研究报道成功插入完整转基因，如斑点叉尾鲷中CRISPR/Cas9介导的转基因插入改善了抗病性和脂肪酸含量。大西洋鲑中虽已报道小片段插入和单核苷酸改变，但较大遗传元件和位点的可靠插入仍具挑战。
探索替代递送策略对克服当前挑战至关重要。在模式鱼类如青鳉中，已建立基于GSC移植的方法批量生产基因编辑不育鱼。鸟类模型中，研究人员结合原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）培养、体外基因组编辑和移植方案生成敲除和敲入模型。因此，借鉴其他动物模型的知识可为水产养殖鱼类开发类似技术提供框架。
3 硬骨鱼类生殖系干/祖细胞、体外培养与移植简述
3.1 生殖系干/祖细胞及其体外培养
生殖系发育涵盖从胚胎发生期间特化的原始生殖细胞（PGCs）到性分化后的生殖系干细胞（GSCs）及成熟配子的多个细胞阶段。PGCs是生殖系细胞的未分化前体，在胚胎早期由母源沉积的生殖质因子特化，随后通过趋化信号迁移至发育中的生殖嵴，在那里增殖并与体细胞支持细胞形成特定解剖微环境。性分化后，部分PGCs成为成体GSCs（雌性为未分化卵原细胞，雄性为精原细胞），可自我更新或进入卵子发生和精子发生产生成熟配子。
体外培养生殖细胞需要分离和富集均一细胞群体。获取胚胎PGCs因丰度低和生殖嵴体积小而在技术上具有挑战性，通常需要基于荧光的方法进行鉴定和回收。Yoshizaki等人开创性地利用转基因虹鳟模型表达由生殖细胞特异性基因调控元件驱动的绿色荧光蛋白，实现PGCs鉴定。尽管在鉴定和分离鱼类PGCs方面取得进展，长期维持和扩增培养仍困难。除斑马鱼中报道的4个月培养方法外，鱼类中稳定的长期PGC培养系统实际上尚不存在。相比之下，成体GSCs因性分化鱼中生殖腺组织较大、细胞数量较多而较易分离。多种模式及水产养殖鱼类中已报道精原细胞（含GSCs）的短期至中期培养。这些系统可能更宜描述为原代细胞培养而非连续维持的细胞系。改进GSC自我更新、增殖和维持的努力包括补充鱼类特异性血清和/或胚胎提取物，以及重组人源生长因子如成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）、白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor, LIF）或胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）。此外，性腺体细胞饲养层被用于更接近体内性腺微环境，对GSC扩增有明显促进作用。
3.2 生殖细胞移植：替代亲本技术
替代亲本技术（surrogate broodstock technology, SBT）涉及通过将生殖细胞移植入不育或生殖细胞耗竭的受体鱼（替代亲本）中，产生供体来源的配子和后代。鲑科鱼类最常用的SBT方法包括从目标未成熟供体性腺组织制备性腺细胞悬液（含GSCs），随后在早期生命阶段（约孵化期）移植入不育化替代亲本。移植后，GSCs迁移并定殖于形成中的生殖嵴，由替代亲本性腺体细胞支持，该体细胞微环境支持供体GSC增殖、分化并最终成熟为携带供体遗传信息的功能性配子。
值得注意的是，在大西洋鲑、虹鳟、马苏鲑和牙鲆等鱼类中，移植GSCs的命运由替代亲本体细胞微环境决定：雌性和雄性替代亲本分别产生卵子和精子，与供体鱼性别无关。因此，这些物种中任一性别的GSCs均可分化为雌雄配子，增加了供体来源鱼生产的灵活性和效率。重要的是，任一性别的GSCs在移植前均可冷冻保存，随后产生功能性配子。与传统仅通过精子冷冻保存常规保留雄性遗传物质（因卵子冷冻耐受性差）的做法相比，SBT可实现雌雄遗传资源的长期保存，从而扩大可储存和利用的遗传多样性范围。
SBT在水产养殖中的应用之一是批量生产遗传性不育鱼。不育是养殖鱼高度期望的性状，可防止逃逸事件后与野生群体的遗传渗入，并减轻性早熟对健康和生长的负面影响。然而，不育性状本身难以从亲本群体传递，尤其是当不育源于生殖细胞缺失时。替代策略是在保留生殖系谱系的同时诱导不育，例如破坏进入青春期所需因子。在青鳉中，破坏卵泡刺激素受体（follicle-stimulating hormone receptor, fshr）基因导致雌性不育和卵巢发育不全，而雄性发育正常睾丸并产生功能性精子。Nagasawa等人将来自XX fshr编辑性逆转雄鱼的GSCs移植入保留功能性体细胞性腺环境的非编辑杂交不育雌性受体中，这些替代亲本成功进行配子发生并产生携带fshr突变的功能性供体来源卵子，随后与XX fshr编辑性逆转雄鱼杂交获得全雌不育后代。在鲑科鱼类中，近期研究表明fshr敲除的大西洋鲑雄鱼以及虹鳟雌雄个体均表现不育。因此，携带fshr敲除突变的GSCs可潜在移植入具有功能性体细胞性腺环境的不育雌雄受体中，通过交配批量生产100%不育后代，无需诱导性逆转或产生单性群体。
4 讨论
基因组编辑结合GSC移植技术有望成为在水产养殖鱼类中引入精准遗传改变的变革性平台。实现这一潜力需要高效的适合移植的基因组编辑GSC制备方法。目前，此类细胞最可能来自已建立并验证的携带明确遗传突变的基因组编辑鱼系。更直接和精细的方法是在移植前对GSCs进行体外编辑、扩增和验证。一种策略涉及从野生型鱼分离GSCs，进行体外基因组编辑，筛选成功编辑的细胞，随后移植入不育替代受体。另一种方案是从基因组编辑的F0嵌合创始鱼中分离GSCs，绕过体外编辑，但该方法仍需通过常规显微注射初始生产F0鱼。两种方案中，支持GSC扩增的稳健培养系统对于产生足够细胞数量并进行预期遗传编辑的筛选和验证至关重要。将验证过的GSCs移植入多个不育（优选生殖细胞缺失）雌雄替代鱼中，可潜在大规模生产携带相同遗传突变的配子。总体而言，基因组编辑、GSC培养和移植技术的整合有望大幅提高可扩展性并缩短建立基因组编辑鱼系的时间。
尽管这些技术具有潜力，建立水产养殖物种稳健生殖细胞培养系统仍面临若干挑战。关键挑战之一是分离和富集足够数量的生殖细胞用于下游应用。PGCs在早期发育阶段数量少，回收通常需要解剖小胚胎。增加可分离PGCs数量的潜在策略是诱导产生PGC样细胞（iPGCs）的新兴技术，通过体内显微注射生殖系决定因子（如dnd1和nanos3）将胚胎细胞导向生殖系命运，但该方法目前仅在模式鱼类中报道。另一方面，幼鱼或成鱼的GSCs因性腺较大和生殖细胞丰度较高而较易获取。移植性生殖细胞的鉴定和分离可通过荧光激活细胞分选结合PGC转基因报告系统，或使用A型精原细胞特异性抗体的磁激活细胞分选实现，但这些工具目前仅适用于有限数量的水产养殖物种。另一个挑战是开发支持生殖细胞体外存活和增殖的明确培养条件。尽管多项研究改进了鱼类GSC培养条件，但尚无通用方案，生长因子和激素需求高度物种特异性。因此，培养基组成、渗透压、温度和补充剂组合等最佳条件须针对每个物种单独确定。此外，与受益于数十年生物医学研究的哺乳动物系统相比，鱼类特异性分子工具和重组蛋白的可用性相对有限。尽管如此，多项研究表明更接近性腺微环境的体细胞饲养层可显著改善不同鱼类的GSC存活和增殖。展望未来，鉴定和生产适当的鱼类特异性重组生长因子和激素可能对建立水产养殖物种稳定GSC培养至关重要。一种有前景的策略是利用单细胞RNA测序或空间转录组学等新兴组学技术阐明性腺内体细胞支持细胞与GSCs之间的特异性细胞间信号通路。
一旦培养条件建立，需开发专门针对GSCs优化的基因组编辑方案。CRISPR基因组编辑已在鱼类体细胞系中通过电穿孔和慢病毒转导方法得到证实，这些研究可作为开发GSC特异性递送方案的基础，但培养GSCs对这些方法的响应程度仍不清楚。近期一项研究调查了多种转染和电穿孔方法对黄鳝原代GSCs的影响，并报道了细胞体外基因组编辑的成功，但该研究未评估编辑细胞能否克隆扩增和基于目标编辑进行筛选，也未进行后续移植，因此生殖系能力和编辑的成功传递尚未确认。一旦在特定物种中成功建立，GSC体外基因组编辑可能为移植前优化精准敲入策略提供机会。对于较小遗传改变如核苷酸变化或小片段插入，HDR可提供产生精准编辑的手段。相反，较大遗传元件如报告基因或转基因的插入可能面临额外挑战，包括HDR效率低、递送相关毒性、随机供体整合或靶位点非预期结构改变。与胚胎显微注射不同，体外培养允许重复测试编辑参数，包括供体模板设计、递送条件以及潜在操纵DNA修复途径活性以偏向HDR。在体细胞或其他脊椎动物系统中改善敲入效率或减少非预期整合的方法可提供有用起点，但其潜在有效性需在鱼类GSCs中验证。
任何体外基因组编辑最初都会产生编辑和未编辑细胞的混合群体（嵌合体），与常规胚胎显微注射基因组编辑后观察到的相似。如果使用来自F0嵌合个体的GSCs也存在同样限制。因此，将此类异质细胞群体移植入不育替代亲本可能导致嵌合配子群体。一个潜在解决方案是从混合细胞群体中分离和扩增单细胞克隆，从而在移植前对单克隆GSC群体进行靶位点筛选和验证，包括确认预期编辑、无意外靶向改变、评估潜在脱靶变化和染色体稳定性。克隆扩增已在奇努克鲑和虹鳟体细胞系中实现，但鱼类GSCs通常难以扩增，作为单克隆扩增可能尤为困难。此外，使用有限数量克隆产生配子可能降低遗传多样性，育种计划因此可能需要纳入多个独立编辑克隆和/或遗传背景以维持多样性。
最终，该方法的可扩展性取决于若干在大西洋鲑中尚未确定的因素。首先，必须分离和扩增足够数量的GSCs，同时保持移植后定殖受体生殖嵴的能力。无论GSCs来自野生型鱼进行后续体外基因组编辑，还是来自基因组编辑的F0嵌合鱼，正确编辑细胞的回收和验证（包括培养条件建立和克隆扩增）将决定可用于移植的验证细胞数量。长期体外培养、基因组编辑和克隆扩增对GSCs及其生殖系能力的影响仍未知，包括GSCs定殖受体性腺及随后发育为功能性配子的能力。虽然非培养野生型GSCs的移植已在大西洋鲑中成功证实，但移植效率迄今仍较低。因此，需要方案优化以实现更高移植成功率，且培养和基因组编辑的GSCs能否保持相当或改善的性腺定殖能力仍有待确定。
其他动物类群的研究可为解决部分挑战提供见解。例如，猪精原细胞已成功进行体外基因组编辑，尽管长期培养系统仍有限。在鸡中，由于单细胞胚胎显微注射不可行，研究人员建立了可体外编辑并随后移植入受体胚胎的PGCs长期培养体系。由于禽类PGCs在胚胎发育期间通过血流迁移，可直接从胚胎血液中分离、编辑、培养扩增并在特异性筛选后注入不育替代胚胎的血液循环中，定殖发育中的性腺。该策略已通过生殖系传递实现非嵌合转基因鸡的生成。尽管鸟类和哺乳动物的生殖生物学与鱼类不同，这些研究为在水产养殖鱼类中开发类似策略提供了有用概念框架。鱼类的一个显著优势是高繁殖力，许多水产养殖鱼类单次产卵产生数千枚卵。如果鱼类能建立高效的GSC培养和移植系统，这可能代表一种特别强大且可扩展的精准育种和优良基因组编辑性状传播方法。
5 结论
基因组编辑有潜力通过加速水产养殖鱼类的遗传增益来补充当前选择性育种计划，例如精准引入抗病性状。虽然少量基因组编辑鱼已获批供人类食用，但基因组编辑在水产养殖中的更广泛实施仍有限，部分归因于监管因素，也与当前鱼类基因组编辑方法相关的若干技术挑战有关。
建立稳健的物种特异性GSC培养和移植方案可能为水产养殖硬骨鱼类实施基因组编辑提供替代平台。特别是，这些方法有望提高可扩展性、减少嵌合体并缩短育种周期。尽管技术挑战仍存，其他动物类群的进展证明了基于GSC技术生成基因组编辑个体的可行性。鉴于许多鱼类的高繁殖力，水产养殖中类似方法可潜在大规模高效生产基因组编辑配子。GSC技术的持续发展，尤其是支持基因组编辑GSCs扩增和克隆扩增的培养系统，可能代表将基因组编辑应用于加速遗传增益、改善水产养殖鱼类健康与福利的重要一步。
