多组学整合揭示复发性阿弗他溃疡中的口腔微生物组-代谢物-免疫互作机制

《Frontiers in Microbiology》：Multi-omics integration reveals oral microbiota-metabolite-immune interactions in recurrent aphthous ulceration

　　

复发性阿弗他溃疡（recurrent aphthous ulceration，RAU）是一种口腔黏膜的慢性炎性疾病，但其潜在机制仍不明确。本研究对16例RAU患者和16例健康对照者进行了口腔微生物组、血清代谢组学和免疫分析的一体化整合研究。16S rRNA测序揭示了RAU患者口腔微生物群落的提示性组成偏移，以梭杆菌属（Fusobacterium）、莫拉菌属（Moraxella）和颗粒链菌属（Granulicatella）的富集以及密螺旋体属（Treponema）和Lancefieldella属的减少为名义趋势。PICRUSt2分析表明与氨基酸代谢和炎症信号传导相关的功能偏移。非靶向代谢组学鉴定出广泛的代谢重塑，包括γ-谷氨酰半胱氨酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、藏红花酸、降植烷酸和含半胱氨酰二肽的改变，提示氧化应激调节和炎症脂质代谢的紊乱。KEGG分析进一步证实了与半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、嘌呤代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢以及初级胆汁酸生物合成相关通路的富集。免疫分析显示CD4⁺ T淋巴细胞亚群的显著改变，并伴随白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平升高。整合相关性分析揭示了差异微生物类群、代谢物和炎症细胞因子之间的密切关联。综上所述，这些发现表明口腔微生物组、血清代谢物和免疫应答的协同改变与RAU相关，为RAU的生物学特征和潜在治疗靶点提供了新的见解，有待进一步研究。

复发性阿弗他溃疡（recurrent aphthous ulceration，RAU）是最常见的口腔黏膜炎性疾病之一，以反复发作的疼痛性溃疡和周边红斑为临床特征，严重影响患者的进食、言语和生活质量。尽管RAU被视为自限性疾病，但其反复发作的特性使患者长期处于炎症与愈合交替的病理状态。目前认为RAU是一种由遗传易感性、免疫异常、微生物失调、营养状态和环境因素共同参与的多因素疾病，但其确切发病机制仍未完全阐明。近年来，口腔微生物群作为口腔黏膜健康与疾病的重要调节因素受到广泛关注。高通量16S rRNA测序技术的进步使得多项研究揭示了RAU患者口腔微生物组成和群落结构的改变，然而既往研究多集中于分类学层面的变化，对微生物失调的功能后果和代谢影响关注不足。代谢组学能够反映宿主与微生物代谢活动的下游功能变化，已有证据表明氧化应激、氨基酸代谢和脂质代谢重塑与黏膜炎症和上皮屏障功能障碍密切相关，但RAU相关的代谢组学特征尤其可能关联口腔菌群失调的代谢特征仍缺乏系统刻画。免疫失调同样是RAU发生发展的关键环节，既往报道显示了T细胞亚群异常和促炎细胞因子增多，然而将口腔微生物组、代谢组学和免疫指标三者进行整合分析的研究极为有限。为此，研究人员开展了这项多组学整合研究，以RAU患者和健康对照者为对象，通过16S rRNA测序表征口腔微生物组成，通过非靶向代谢组学刻画血清代谢改变，并结合流式细胞术和酶联免疫吸附测定评估免疫状态，旨在鉴定疾病相关的微生物和代谢特征，探索微生物失调、代谢重编程和免疫失衡之间的潜在相互作用。该研究前瞻性连续入组了来自河南中医药大学第一附属医院脾胃肝胆病科和口腔科的16例RAU患者，并同时按1:1比例招募了16例年龄和性别匹配的健康对照者。研究结果表明RAU患者存在口腔微生物多样性和群落结构的改变、血清代谢谱的广泛重塑以及CD4⁺ T细胞减少和促炎细胞因子升高，整合相关分析进一步揭示了差异微生物类群、代谢物和免疫指标之间的协调关联网络，为理解RAU的病理机制和寻找潜在生物标志物及治疗靶点提供了新的视角和理论依据。

在技术方法层面，研究人员主要运用了以下几种关键手段。口腔微生物组分析基于唾液样本的16S rRNA基因V3-V4区域扩增子测序（Illumina MiSeq平台），采用UNOISE3算法生成Amplicon Sequence Variants（ASV）并进行生物信息学分析，随后使用PICRUSt2依据ASV系统发育关系预测微生物群落的KEGG直系同源基因和MetaCyc代谢通路。血清代谢组学采用基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用（UHPLC-Q Exactive MS）的非靶向代谢组学方法，在正负离子模式下采集数据，经XCMS处理并通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）评估数据质量和组间分离，差异代谢物筛选标准为VIP>1.0、FC>1.5或<0.667且p<0.05。免疫状态评估采用流式细胞术定量外周血CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞亚群，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清IL-1、IL-6和TNF-α水平。整合分析采用Spearman等级相关分析构建相关性网络，阈值为|r|>0.5且p<0.05，可视化工具为OmicStudio平台。

研究结果部分，研究人员首先对基线特征进行了比较分析。共纳入32名受试者，其中RAU组16例、健康对照组16例，两组的年龄、性别分布和体质指数差异均无统计学意义（p>0.05），表明组间具有良好的可比性，最大程度减少了潜在的混杂偏倚。在口腔微生物多样性和群落结构方面，研究人员通过α多样性和β多样性分析发现，RAU组的Shannon指数和Simpson指数虽较对照组呈下降趋势但未达统计学显著意义，提示微生物丰富度和多样性存在一定程度的降低；基于unweighted UniFrac距离的β多样性分析通过主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）显示RAU患者与健康对照之间存在明显分离，表明疾病状态下微生物群落结构发生了实质性重塑。在差异微生物类群鉴定方面，研究人员通过门水平和属水平的相对丰度比较发现，RAU组中梭杆菌门（Fusobacteriota）和Patescibacteria呈增加趋势而螺旋体门（Spirochaetota）呈减少趋势；属水平上，Fusobacterium、莫拉菌属和颗粒链菌属在RAU组呈富集趋势，而密螺旋体属和Lancefieldella属呈减少趋势。Similarity Percentage（SIMPER）分析显示奈瑟菌属（Neisseria）、普雷沃菌属（Prevotella）和嗜血杆菌属（Haemophilus）是造成组间微生物差异的主要贡献类群。火山图分析和热图聚类进一步显示了这些类群的差异丰度模式，但颗粒链菌属和Lancefieldella属在Benjamini-Hochberg错误发现率校正后未保持统计学显著。在PICRUSt2功能预测方面，预测功能丰度谱的PCA分析显示RAU组与对照组明显分离，Venn图显示RAU组有137个独特的预测功能，对照组有11个独特功能，两组共享6118个功能；KEGG通路分析显示与氨基酸代谢、碳水化合物代谢和炎症信号传导相关的通路存在差异富集，其中涉及信号分子和相互作用的感染相关通路丰度改变，提示微生物失调可能主要通过功能重编程而非仅仅组成变化参与疾病发展。在血清代谢组学全局分析方面，负离子模式下鉴定到的化合物主要归属于脂质和脂质样分子（44.30%）、有机杂环化合物（14.44%）和有机酸及其衍生物（12.18%），正离子模式下则以脂质和脂质样分子（37.54%）、有机酸及其衍生物（18.53%）和有机杂环化合物（17.39%）为主；两种离子模式下的PCA均显示RAU组与对照组之间存在分离趋势，质控样本紧密聚集和强相关证明平台稳定性良好。在差异代谢物鉴定方面，负离子模式下依据预定义筛选标准鉴定出55种显著改变的代谢物，其中16种上调、39种下调；正离子模式下鉴定出204种显著改变的代谢物。热图和箱线图证实了这些疾病相关代谢特征的稳定性，代表性代谢物包括γ-谷氨酰半胱氨酸、降植烷酸、十一碳二酸、羟乙磺酸、二十碳五烯酸（EPA）、藏红花酸、醋酸可的松和半胱氨酰-组氨酸二肽，这些代谢物主要涉及谷胱甘肽代谢、脂质氧化和微生物相关代谢过程。在KEGG通路富集与代谢网络分析方面，负离子模式富集的通路包括咖啡因代谢、药物代谢-其他酶类、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、β-丙氨酸代谢以及烟酸和烟酰胺代谢；正离子模式富集的通路包括核苷酸代谢、嘌呤代谢、咖啡因代谢、初级胆汁酸生物合成以及牛磺酸和次牛磺酸代谢。网络分析显示氨基酸代谢、嘌呤代谢、氧化应激调节和炎症脂质代谢相关通路在调节网络中占据重要位置，表明RAU存在协调的代谢重编程。在T细胞亚群和炎症细胞因子改变方面，流式细胞术分析显示RAU患者CD4⁺ T细胞水平显著降低（p<0.05），而CD8⁺ T细胞水平和CD4⁺/CD8⁺比值差异无统计学意义；ELISA检测显示RAU组血清IL-1、IL-6和TNF-α水平均显著升高（p<0.05），反映了系统性炎症状态。在整合分析方面，Spearman相关分析显示颗粒链菌属与促炎细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α显著正相关，Lancefieldella属与炎症细胞因子呈负相关并与抗氧化相关代谢物正相关；γ-谷氨酰半胱氨酸和含半胱氨酰二肽与炎症相关菌属和促炎细胞因子负相关，与CD4⁺ T细胞相关免疫平衡指标正相关；EPA和藏红花酸与炎症细胞因子负相关并与潜在有益菌属正相关；参与嘌呤代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢以及半胱氨酸和甲硫氨酸代谢的代谢物在相关网络中与微生物丰度和免疫指标密切关联。

在讨论部分，研究人员系统总结了本研究的核心发现。口腔菌群失调、代谢紊乱和免疫功能障碍被普遍认为共同参与RAU的发病过程，本研究通过整合多组学分析进一步揭示了三者之间的协调关联网络。口腔微生物组方面，RAU患者存在群落结构的显著改变而非简单的多样性丧失，Fusobacterium、颗粒链菌属等促炎菌属的富集可能营造了促炎性微环境，而Lancefieldella和密螺旋体属的减少可能反映了潜在有益共生菌的丢失，这一发现与既往报道的RAU相关菌群失调一致。PICRUSt2功能预测提示微生物失调的影响延伸至功能层面，氨基酸代谢和炎症信号通路的功能重编程可能构成微生物参与宿主炎症过程的重要渠道。代谢组学方面，RAU患者表现出涉及氧化应激、脂质代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢的广泛系统代谢重塑。γ-谷氨酰半胱氨酸作为谷胱甘肽合成的前体物质，其改变强烈提示谷胱甘肽依赖性抗氧化防御系统的紊乱；EPA作为合成促消退介质的关键ω-3多不饱和脂肪酸，其相关信号受损可能参与炎症持续和组织修复延迟；藏红花酸和含半胱氨酰二肽与抗氧化能力和活性氧清除密切相关，进一步支持RAU患者存在氧化应激失衡。免疫方面，CD4⁺ T细胞亚群比例改变和IL-1、IL-6、TNF-α水平升高表明适应性免疫应答失衡和系统促炎状态。整合相关分析揭示的微生物-代谢物-免疫关联轴提示口腔微生物失调、氧化应激、谷胱甘肽相关抗氧化通路和炎症脂质代谢改变与T细胞失衡、细胞因子产生和上皮损伤之间存在内在联系。然而，研究人员明确指出由于样本量较小和横断面设计，口腔微生物与循环代谢物之间的生物学联系及因果关系尚需进一步验证，生活方式和临床混杂因素（如饮食习惯、吸烟状态、口腔卫生、月经周期和疾病严重程度评分）的信息缺失也限制了混杂效应的调整和疾病活动度关联的评估。未来需要纳入全面协变量采集、标准化严重程度评估和纵向机制设计的前瞻性研究来验证和拓展这些发现。

在结论部分，研究人员指出，本研究结果支持一种整合的关联模型，即复发性口腔溃疡患者的口腔微生物失调、代谢改变和免疫应答相互关联。这些协调变化与氧化应激相关特征、脂质代谢改变和免疫激活相关，可能反映了参与黏膜功能障碍的生物学过程。这一整合框架为复发性口腔溃疡的分子特征提供了新的见解，并强调了包括口腔微生物组调节和代谢与免疫稳态调控在内的潜在治疗策略，但需在未来的机制研究中进一步验证。