有机酸复合抗菌剂通过谷胱甘肽抗氧化防御减轻迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）诱导的鳃上皮细胞毒性损伤

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Glutathione-linked antioxidant defence limits Edwardsiella tarda-induced cytotoxicity in organic acid-treated gill epithelial cells

　　

摘要专业翻译 鳃上皮细胞的毒性损伤是病原体感染的主要后果之一，可损害水产养殖物种的屏障功能。迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是水产养殖中重要的细菌性病原体。感染鳃上皮细胞可破坏屏障完整性、诱导细胞毒性，并触发氧化应激和炎症应激反应。本研究评估了AuraAqua（Aq）——一种基于有机酸的抗菌复合物——是否能够保护RTgill-W1细胞免受E. tarda诱导的细胞毒性及相关的炎症和氧化应激反应。Aq的最低抑菌浓度（MIC）为1%，最低杀菌浓度（MBC）为2%。Aq处理减少了E. tarda的黏附及胞内细菌回收量，表明早期宿主-病原体相互作用受到干扰。重要的是，在测试浓度（0、0.1、0.2、0.5、1和2%）下，Aq对RTgill-W1细胞无直接细胞毒性，并减少了感染相关的乳酸脱氢酶（LDH）释放，同时保持了细胞活力和跨上皮电阻（TEER）。这些结果伴随着紧密连接相关基因表达的增加，包括cldn-10e、cldn-30和zo-1。在感染期间，Aq增强了细胞内谷胱甘肽（GSH）水平，降低了超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，减少了H2O2的积累，并降低了NF-κB p65的激活。Aq还显著下调了感染细胞中IL-8、IL-1β和TNF-α的表达。综上所述，这些发现表明Aq能够刺激内源性GSH产生的增加，这主要保护RTgill-W1细胞并限制E. tarda诱导的细胞毒性损伤。这增强了抗氧化防御能力，维持了上皮屏障完整性，并抑制了NF-κB相关的炎症信号传导。

论文解读

一、研究背景与科学问题

鱼类鳃部结构体现了一种生物学上的妥协：薄而高度暴露的上皮必须同时维持气体交换和离子调节功能，又要防御水传播微生物的侵袭。这种结构特点使上皮屏障完整性处于早期宿主-病原体相互作用的核心位置。虹鳟RTgill-W1细胞系为此提供了理想的研究模型，因为它能形成具有电阻性的单层结构，表达紧密连接相关基因，并能诱导先天免疫应答。在该模型中，跨上皮电阻（TEER）可作为屏障功能的行为学读数，而cldn-10e、cldn-30和zo-1是该模型中已确立的紧密连接相关转录本。

氧化应激适应与胞内增殖在代谢上相互整合。活性氧（ROS），特别是H₂O₂，在生理浓度下作为调控性信号中间体，但当产生量超过局部缓冲和修复能力时则具有损伤性。在RTgill-W1细胞中，实验诱导的线粒体氧化应激可增加ROS并伴随GSH和过氧化氢酶的耗竭，表明该细胞系对细胞内氧化还原缓冲的变化敏感。已有研究表明，膳食GSH可减轻草鱼鳃部缺氧相关的结构和氧化损伤，而银鲫日粮中苹果酸/柠檬酸组合可改变GSH状态及生理和免疫指标。在嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染模型中，GSH或牛磺酸/GSH处理可减少ROS积累、抑制NF-κB激活并改变IL-1β和TNF-α的表达，将氧化还原缓冲与炎症控制联系起来。

迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）因其环境持久性、系统性感染能力、胞内生存、免疫逃逸及跨多种鱼类宿主的致病性，仍是水产养殖中的重要细菌病原体。然而，其经济重要性远不如致病重要性被精确量化，部分原因是历史疾病记录早于鱼类相关爱德华氏菌属的物种分类分离。据估算，美国鲶鱼产业中爱德华氏菌病每年造成直接损失520万至1760万美元，总负面经济影响达1550万至4590万美元，约占2023年美国鲶鱼年销售额的1.2%至10.5%。

目前存在的关键机制空白在于E. tarda致病机制与鳃上皮保护之间的交叉领域：尚不清楚亚抑制浓度的有机酸抗菌复合物是否能在保持屏障功能的同时干扰E. tarda与上皮细胞的早期相互作用，并约束感染期间产生的氧化还原-炎症扰动。此前的机制研究已初步分离有机酸复合物的病原体导向效应与宿主导向效应：在罗非鱼肠道模型中，Aq减少了无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）感染及H₂O₂和炎症读数；在虾上皮细胞中，该配方在肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei）攻毒期间减弱了感染相关的H₂O₂和NF-κB p65激活；在嗜水气单胞菌感染的罗非鱼和虾原代肠道细胞研究中，上皮屏障完整性得以保持，Aq处理降低了细胞毒性和氧化应激指标。

有机酸在组合使用时可通过柠檬酸、富马酸和L-苹果酸的组合增强鱼类抗氧化状态并支持谷胱甘肽相关防御机制。在加州鲈鱼中，这些有机酸组合可提高肝脏抗氧化能力，包括CAT、总抗氧化能力（T-AOC）和GSH-PX活性增加，以及抗氧化相关基因表达上调。由于GSH-PX活性依赖于还原型谷胱甘肽的可用性和周转，这些发现提示有机酸混合物可能促进谷胱甘肽代谢并加强细胞抗氧化保护。

基于上述背景，本研究旨在利用RTgill-W1鳃上皮细胞系作为先进的体外模型，评估AuraAqua（Aq）——一种基于有机酸的抗菌复合物——对E. tarda诱导的细胞损伤的保护作用。Aq结合了柠檬酸、柠檬酸钠、苹果酸、柑橘提取物、橄榄提取物及载体成分，可能协同作用以减少E. tarda与宿主细胞的相互作用、增强谷胱甘肽相关抗氧化应答并限制NF-κB相关炎症。这种多组分策略可能在细菌毒力、氧化应激、炎症信号传导和上皮屏障破坏同时发生的复杂感染环境中提供比单一有机酸更稳健的保护。

二、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：RTgill-W1-CRL-2523细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），在DMEM培养基中20°C培养。E. tarda ATCC 15947菌株在TSB培养基中28°C培养。采用二倍试管稀释法测定Aq的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。感染实验以MOI为100进行，感染持续3天（72小时）。通过MTT法测定细胞活力，通过LDH释放评估细胞毒性，通过EVOM X仪连接Endohm室测量跨上皮电阻（TEER）。使用qPCR分析紧密连接基因（cldn-10e、cldn-30、zo-1）和炎症基因（IL-8、IL-1β、TNF-α）的mRNA表达，以EF-1α和β-actin为内参基因。采用商品化试剂盒测定SOD、CAT活性和H₂O₂水平。使用GSH/GSSG比值检测试剂盒测定细胞内GSH浓度。使用核提取试剂盒和NF-κB p65转录因子检测试剂盒测定NF-κB p65激活水平。统计分析采用GraphPad软件11版，使用单因素方差分析和?ídák多重比较检验。

三、研究结果

3.1 Aq对RTgill-W1细胞中E. tarda毒力的影响**

研究人员首先通过生长曲线和抑制分析确定了Aq的MIC为1%、MBC为2%，并将0.5%确定为亚抑制浓度用于后续机制研究。结果表明，Aq处理（0%、0.1%、0.2%、0.5%、1%和2%）显著降低了E. tarda的总黏附量和胞内细菌回收量（P < 0.0001），表明该有机酸复合物可能干扰早期宿主-病原体相互作用以及细菌进入或在上皮细胞模型内存活的能力。黏附是细菌定植的重要第一步，而内化可促进持续感染和疾病进展。

3.2 Aq对感染和未感染RTgill-W1细胞活力、细胞毒性和跨上皮电阻的影响

MTT检测显示，Aq在所测试浓度下未显著降低细胞活力，表明该复合物在实验条件下被RTgill-W1细胞良好耐受。在E. tarda感染和未感染细胞中，Aq暴露均与LDH释放减少相关，表明感染相关细胞毒性降低。TEER测量进一步表明，Aq在感染期间有助于保持上皮屏障完整性，而未感染单层仅显示有限的破坏。这些结果表明Aq在所测试浓度下对RTgill-W1细胞无直接细胞毒性，并可能保护细胞免受E. tarda诱导的细胞损伤和屏障功能障碍。

3.3 Aq上调RTgill-W1细胞紧密连接相关基因的表达

qPCR分析显示，Aq处理在感染和未感染细胞中均增加了cldn-10e、cldn-30和zo-1的相对mRNA表达，表明Aq促进与紧密连接结构和上皮屏障维持相关基因的表达。这一反应在E. tarda感染期间尤为相关，增加的紧密连接基因表达可能有助于TEER检测中观察到的上皮完整性保持。

3.4 Aq处理对RTgill-W1细胞氧化应激的影响

在未感染细胞中，Aq处理未引起CAT活性的显著浓度依赖性变化，而感染细胞在Aq暴露后CAT活性降低。Aq在E. tarda感染细胞中显著降低了SOD活性（P < 0.0001）。在未感染细胞中检测到基线H₂O₂水平，而感染细胞在所有测试浓度的Aq存在下H₂O₂水平显著降低（P < 0.0001）。这些结果表明Aq本身不会在RTgill-W1细胞中引起氧化应激反应，但可能在E. tarda感染期间调节氧化应激反应。

3.5 Aq对RTgill-W1细胞谷胱甘肽和NF-κB激活的影响

在感染后72小时，Aq以剂量依赖性方式显著增加细胞内GSH水平，在E. tarda感染细胞中反应最强（P < 0.0001），未感染细胞中也观察到类似但较弱的增加。相反，Aq降低了NF-κB p65激活，特别是在感染期间，表明感染诱导的炎症信号传导受到抑制。在0.5%亚抑制浓度下，Aq产生了时间依赖性的GSH增加，而H₂O₂产生没有相应增加，表明Aq诱导的氧化应激并非导致GSH升高的原因。GSH转运蛋白mRNA表达分析（包括mrp1、oatp1d1和sec61a1）也被用于探究细胞内GSH水平改变的分子机制。

3.6 Aq对RTgill-W1细胞IL-8、IL-1β和TNF-α炎症基因表达的影响

E. tarda感染改变了这些炎症标志物的表达。Aq处理以浓度依赖性方式改变了这一反应，在所有测试浓度下均显著降低了IL-8、IL-1β和TNF-α的表达（P < 0.0001）。这些结果表明Aq可能在E. tarda感染期间调节RTgill-W1细胞的炎症反应，从而有助于其对细胞活力、细胞毒性、氧化应激和上皮屏障完整性的保护作用。

四、讨论与结论

讨论部分指出，Aq减少了E. tarda感染RTgill-W1细胞的关键早期事件，包括降低总细菌黏附和胞内细菌回收，表明其对细菌附着、进入或胞内生存的干扰作用。MTT和LDH检测证实Aq不损害细胞活力并减少感染相关细胞毒性。TEER结果与紧密连接基因表达增加一致，表明Aq在分子水平上强化了紧密连接完整性。

关于GSH升高的机制，讨论提出了可能的NRF2通路上调，这是维持细胞稳态的抗氧化和解毒基因的细胞调节因子。Aq的组分中，柠檬酸可防止还原型谷胱甘肽耗竭并增强谷胱甘肽过氧化物酶活性；膳食苹果酸可增加总抗氧化能力和GSH-Px等抗氧化酶活性；麦芽糊精可通过支持GSH合成所需氨基酸间接影响GSH。研究还强调，GSH水平升高并不一定反映细胞损伤——健康细胞可能主动增加GSH储备作为预防性防御缓冲或支持必需代谢过程，这解释了H₂O₂水平降低与GSH升高之间的表观不一致。Aq对感染细胞中CAT和SOD的降低作用与GSH水平无直接关联，因为GSH并不直接触发或调节CAT和SOD的产生。

关于GSH与促炎细胞因子的关系，讨论指出GSH作为主要内源性抗氧化剂，而TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子介导免疫和炎症反应。研究观察到Aq在感染和未感染细胞中均诱导GSH增加、H₂O₂产生减少以及IL-8、IL-1β和TNF-α mRNA水平降低，这些事件均与NF-κB通路激活减少相关。已有研究支持还原型GSH减少和氧化应激增加可激活NF-κB通路，触发鳃组织中TNF-α、IL-1β和IL-8等促炎细胞因子的转录和释放。有机酸混合物在感染期间也可阻断NF-κB通路的激活，减少氧化应激和促炎反应。

研究结论：本研究证明AuraAqua（Aq），一种基于有机酸的抗菌复合物，可保护RTgill-W1鳃上皮细胞免受迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）诱导的细胞损伤。Aq减少了细菌黏附和胞内细菌回收，保持了细胞活力，降低了LDH释放，并帮助维持上皮屏障完整性，表明其对感染相关细胞毒性和屏障破坏具有保护作用。这些效应伴随着紧密连接相关基因表达增加、细胞内谷胱甘肽水平增强、氧化应激反应降低、NF-κB激活减少以及IL-8、IL-1β和TNF-α等促炎标志物表达下调。综合来看，这些发现表明Aq通过限制早期宿主-病原体相互作用、增强抗氧化防御和抑制炎症信号传导来支持鳃上皮的恢复力。研究结果凸显了基于有机酸的抗菌复合物作为功能性策略在水产养殖相关模型中减少病原体相关鳃损伤的潜力。需要进一步的体内研究来确认这些效应在鱼类中的表现，并阐明Aq介导的上皮屏障、氧化应激和免疫反应调节机制。