三株假单胞菌（Pseudomonas）对柑橘酸腐病菌Geotrichum citri-aurantii的促生特性与生物防治机制

《Frontiers in Microbiology》：Plant growth-promoting traits and biocontrol mechanism of three Pseudomonas strains against Geotrichum citri-aurantii

　　

背景：植物促生根际细菌（plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR）在改善植物生长表现和增强植物抗病性方面发挥重要作用。假单胞菌属（Pseudomonas）物种因其优异的植物促生和生物防治潜力，被广泛认为是有前景的有益微生物。

方法：研究人员从中国广东省采集的马铃薯和番茄根际土壤中分离出三株细菌，分别命名为MBJ003、MBJ016和MB1046。基于形态学特征、生理生化特性、系统发育分析及全基因组分析进行了分类学鉴定。进一步表征了基因组特征、植物促生性状以及对柑橘酸腐病菌Geotrichum citri-aurantii的抗真菌活性，并探究了菌株MB1046中VI型分泌系统（type VI secretion system, T6SS）的功能。

结果：菌株MBJ003被鉴定为Pseudomonas paraeruginosa，MB1046被鉴定为Pseudomonas palmensis，而MBJ016代表假单胞菌属的一个新种。全基因组测序揭示了丰富多样的次生代谢物生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters, BGCs），这些基因簇构成了其生物防治能力的基础。此外，菌株MB1046含有17个T6SS组分。三株菌均表现出多种植物有益性状，包括 solubilization of phosphate（溶磷）、siderophore合成（铁载体合成）和IAA产生（吲哚乙酸产生），其中菌株MBJ003还表现出蛋白酶活性。三株菌对G. citri-aurantii表现出强烈的拮抗作用。它们的无细胞发酵上清液具有抗真菌效果，其中MBJ003的抑制作用最强。体外接种试验证实，这些菌株能有效控制由G. citri-aurantii引起的柑橘采后病害。研究人员进一步揭示了MB1046通过T6SS介导的对G. citri-aurantii的拮抗作用。

结论：本研究系统表征了三株假单胞菌的植物促生特性和抗真菌机制。这些菌株是开发用于防治作物采后病害的生物防治剂的重要微生物候选资源。

植物促生根际细菌（PGPR，即plant growth-promoting rhizobacteria，一类定殖于根系并能促进植物生长的有益细菌）在改善植物生长和增强抗病性方面具有双重农业生态功能。假单胞菌属（Pseudomonas）因环境适应性强、根际定殖稳定且次生代谢多样，被认为是理想的微生物接种剂。然而，现有研究多聚焦于假单胞菌的单一促生性状或单一作物场景，对其促生效果、对柑橘采后病害的生防能力以及抗真菌分子机制缺乏系统评价。为此，研究人员从广东省惠州市马铃薯根际分离出菌株MB1046，从广州市番茄根际分离出菌株MBJ003和MBJ016，并对这三株具有无机磷溶解能力的细菌开展了全面研究。

研究人员首先综合运用形态学、生理生化测定、16S rRNA系统发育分析以及全基因组平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）和数字DNA-DNA杂交（digital DNA-DNA hybridization, dDDH）比较，对菌株进行分类鉴定。随后通过Illumina HiSeq平台完成全基因组测序，利用antiSMASH数据库预测次生代谢物生物合成基因簇（BGCs），并通过KEGG注释重建T6SS组分。同时，采用钼锑抗比色法测定溶磷量，CAS平板法检测铁载体，Salkowski比色法定量IAA，Folin酚法测定蛋白酶活性。生防评价包括平板对峙法、发酵上清液抑菌试验以及离体柑橘果实接种试验。针对菌株MB1046，通过同源重组构建了T6SS效应基因vgrG缺失突变体（ΔvgrG），并结合共培养、平行点样和0.22 μm PVDF膜物理分离试验，解析T6SS在抗真菌中的功能。

研究结果如下：

（1）三株假单胞菌的分类鉴定：形态学观察显示三株菌均为典型短杆状，生理生化测试表明均为革兰氏阴性、氧化酶阳性、过氧化氢酶阳性。16S rRNA系统发育树显示MBJ003与P. paraeruginosa PA7^T、MB1046与P. palmensis BBB001^T聚于同一分支，ANI和dDDH值均高于物种界限（分别为99.1%/91.7%和99.1%/93.8%），而MBJ016与最相近物种的ANI为79.0–93.7%，dDDH为23.2–55.1%，低于物种划分阈值，因此被鉴定为假单胞菌属新种。

（2）全基因组注释与比较基因组分析：三株菌的基因组大小分别为6.4、5.4、5.7 Mbp，GC含量为66.6%、62.4%、64.3%。antiSMASH预测到MBJ003、MBJ016、MB1046分别含有15、8、9个BGCs，其中ripp-like3、NAGGN4、redox-cofactor和Pf-5 pyoverdine为三株菌共有。此外还发现pseudopaline、vibrioferrin、pseudomonine和hydrogen cyanide等与已知功能BGCs具有100%相似性的基因簇，以及多个低同源性的潜在新基因簇。KEGG注释显示MB1046含有由12个核心组分和5个相关蛋白组成的T6SS。

（3）三株假单胞菌的植物促生特性：液体培养测定表明，三株菌均具有无机磷溶解能力，MBJ003、MBJ016、MB1046的溶磷量分别为48.4±0.66、50.6±0.03、46.6±0.11 mg L^?1。CAS平板显示三株菌均产生铁载体。在含L-色氨酸的培养基中，IAA产量分别为1.59±0.22、6.43±0.33、10.63±1.78 μg mL^?1。此外，仅MBJ003表现出蛋白酶活性，为25.43±1.23 U mL^?1。

（4）三株假单胞菌对G. citri-aurantii的拮抗活性：平板对峙试验中，MBJ003、MBJ016、MB1046对G. citri-aurantii TSF19的抑制率分别为67.0%、73.6%和64.4%。无细胞发酵上清液也表现抑菌作用，抑制率分别为59.7%、20.5%和16.1%，其中MBJ003最强，表明胞外可扩散代谢物参与抗真菌过程。

（5）三株假单胞菌对柑橘酸腐病的生防效果：离体柑橘果实试验中，三株菌处理均显著降低病斑面积，MBJ003的生防效果最高（76.9%），其次为MB1046（68.0%）和MBJ016（55.5%），证明其对柑橘酸腐病具有良好防治潜力。

（6）T6SS在菌株MB1046拮抗G. citri-aurantii中的作用：通过同源重组成功构建ΔvgrG突变体。共培养试验显示，ΔvgrG几乎丧失对TSF19的抑制能力，而野生型MB1046仍能有效抑制真菌生长。平行点样试验进一步证实ΔvgrG的抑菌活性显著弱于野生型。当利用PVDF膜将细菌与真菌物理分离后，ΔvgrG完全失去抗真菌活性，而野生型仍保留部分抑制效果，表明MB1046通过T6SS以接触依赖方式发挥抗真菌作用。

讨论部分指出，三株菌含有的多种次生代谢物BGCs，如pyoverdine、vibrioferrin、pseudomonine、hydrogen cyanide等，可能通过铁营养竞争、呼吸链干扰、膜损伤及蛋白合成抑制等机制抑制病原菌。同时，T6SS介导的接触依赖抗真菌效应与胞外代谢物的协同作用，构成了假单胞菌的潜在抑菌策略。研究结论为：本研究系统阐明三株假单胞菌的植物促生特性及其对G. citri-aurantii的生物防治机制，这些菌株是开发作物采后病害生物防治剂的高价值微生物候选资源，为绿色农业中微生物肥料和生防制剂的研发奠定了理论基础。