奥氮平以Mdivi-1抵抗方式破坏骨骼肌细胞胰岛素信号传导及其与DRP1的相互作用

《Frontiers in Pharmacology》：Olanzapine induces Mdivi-1-resistant disruption of insulin signaling in skeletal muscle cells

　　

第二代抗精神病药物如奥氮平（olanzapine, OLZ）因较少引起第一代药物相关的锥体外系不良反应而被广泛处方。然而，OLZ与代谢功能障碍密切相关，且线粒体动力学改变被认为可能参与这些效应。研究人员研究了OLZ诱导的线粒体功能障碍是否与骨骼肌细胞中胰岛素信号传导受损相关，并探讨了其与线粒体分裂调节因子动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1, DRP1）的潜在相互作用。方法：采用OLZ单独或联合线粒体分裂抑制剂Mdivi-1处理L6骨骼肌成肌细胞，评估胰岛素信号传导、葡萄糖摄取、线粒体形态以及胰岛素刺激的线粒体生物能学。同时，利用常用DRP1/Mg²⁺受体模型进行分子动力学模拟和MM/PBSA计算，比较高质子化状态OLZ与Mdivi-1在DRP1 GTPase结构域内的相互作用。结果：OLZ降低胰岛素介导的信号传导和葡萄糖摄取，促进线粒体碎片化，并损害胰岛素诱导的线粒体生物能活性增强。与Mdivi-1共处理可部分挽救OLZ诱导的线粒体碎片化，但未能恢复胰岛素反应性。分子模拟显示，质子化的OLZ与Mdivi-1位于DRP1 GTPase结构域同一疏水区域，并共享涉及Ile252的锚定相互作用。两者计算的MM/PBSA相互作用自由能相近（分别为?22.26 ± 1.7和?24.50 ± 0.5 kcal mol^?1），支持其能够兼容占据同一结合区域，但不证明其具有高亲和力或GTP竞争性结合。讨论：这些发现表明，OLZ在破坏骨骼肌细胞线粒体动力学和生物能学的同时降低胰岛素敏感性。然而，线粒体形态恢复与胰岛素抵抗持续存在之间的分离提示，过度的线粒体分裂本身并不能解释OLZ诱导的代谢功能障碍。计算结果与OLZ与DRP1 GTPase结构域相互作用相符，但并未确定DRP1为其主要药理学靶点。因此，OLZ相关的胰岛素抵抗可能涉及其他潜在线粒体外的机制。

第二代抗精神病药物（second-generation antipsychotics, SGAs）如奥氮平（olanzapine, OLZ）因锥体外系不良反应较少而被广泛使用，但OLZ与体重增加、高血糖和胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）风险增加密切相关，且其代谢风险高于阿立哌唑等其他SGAs。骨骼肌是胰岛素刺激下葡萄糖摄取和氧化的主要外周组织，因此成为这类药物代谢毒性的重要靶点。已有研究表明OLZ可直接损害L6肌细胞胰岛素信号，并诱导线粒体碎片化，而DRP1抑制剂Mdivi-1在部分2型糖尿病细胞模型中可恢复胰岛素信号。然而，OLZ诱导的线粒体功能障碍与肌肉胰岛素抵抗之间的因果关系尚不明确。研究人员旨在通过L6骨骼肌成肌细胞模型，评价Mdivi-1能否阻止OLZ诱导的线粒体碎片化和胰岛素抵抗，从而恢复葡萄糖稳态；同时，利用计算模拟探讨OLZ是否可能直接作用于线粒体分裂执行蛋白DRP1。

研究人员使用ATCC来源的L6骨骼肌成肌细胞，以160 μM OLZ和/或10 μM Mdivi-1处理24 h，并以100 nM胰岛素刺激30 min。主要技术包括：碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色流式细胞术检测细胞活力；Western blot检测Akt Ser473和ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化；2NBDG摄取实验检测葡萄糖转运；Clark氧电极法测定耗氧率；TMRM染色评估线粒体跨膜电位；生物发光法检测细胞内ATP含量；Mitotracker Green染色结合ImageJ/MiNA插件分析线粒体形态。计算部分以人DRP1 GTPase结构域晶体结构（PDB 4H1V）为受体，进行FRED分子对接、10 ns全原子分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟和MM/PBSA结合自由能计算，比较OLZ、Mdivi-1、Drpitor1a及DRP1i27等配体的结合模式。

研究结果如下。

3.1 Mdivi-1可挽救OLZ诱导的L6成肌细胞活力丧失。PI染色流式细胞术显示，OLZ单独处理使细胞活力轻度但显著下降（约91%），10 μM Mdivi-1与OLZ联用可将活力恢复至对照水平，而1 μM Mdivi-1无效；亮场显微镜下联用组出现细胞空泡化，但OLZ单独不改变细胞形态。

3.2 Mdivi-1不能挽救OLZ诱导的L6成肌细胞胰岛素信号传导破坏。Western blot显示100 nM胰岛素可显著增强Akt和ERK1/2磷酸化，OLZ预处理则阻断该增强效应并抑制胰岛素刺激的2NBDG葡萄糖摄取。Mdivi-1单独本身即抑制Akt和ERK磷酸化，且与OLZ联合时仍不能恢复胰岛素信号或葡萄糖摄取。

3.3 Mdivi-1不能挽救OLZ诱导的L6成肌细胞线粒体生物能学破坏。耗氧率、TMRM膜电位和ATP检测显示，胰岛素在对照组未显著改变这些指标；OLZ单独或联合Mdivi-1均降低线粒体跨膜电位，Mdivi-1未能防止这一下降。

3.4 OLZ诱导L6成肌细胞线粒体碎片化，而联合Mdivi-1表现出混合效应。Mitotracker Green荧光成像和MiNA分析显示，OLZ显著增加碎片状线粒体比例并减少线粒体网络；Mdivi-1单药未显著改变形态；两药联用时Mdivi-1仅部分维持线粒体网络数量，却反而减少长管状线粒体；各组总线粒体数不变，提示这些改变源于形态重塑而非线粒体生物量变化。

3.5 OLZ与DRP1 GTPase结构域的结合亲和力与Mdivi-1及其他DRP1抑制剂在计算机模拟中相似。FRED分子对接将OLZ、Mdivi-1、Drpitor1a及DRP1i27均定位到DRP1 GTP结合口袋，OLZ预测结合自由能（ΔG = ?5.11 kcal·mol^?1）略优于Mdivi-1（?4.96 kcal·mol^?1），并接触多个催化必需残基，提示其可能占据GTP竞争性位点。

3.6 分子动力学和MM/PBSA分析揭示质子化状态依赖的口袋保留，以及Mdivi-1与OLZ-H⁺之间的相近亲和力。10 ns MD显示，中性OLZ迅速从口袋脱离（质心漂移12.69 ± 15.72 ?，埋藏表面积降至0），而生理条件下占优的哌嗪质子化形式OLZ-H⁺可稳定保留于催化裂隙，与Mdivi-1共享Ile252疏水锚定；MM/PBSA计算表明，ε_in = 4.0时Mdivi-1结合自由能为?24.50 ± 0.45 kcal/mol，OLZ-H⁺为?22.26 ± 1.75 kcal/mol，两者差异无统计学意义，但均不配位催化性Mg²⁺离子。

讨论部分指出，Mdivi-1虽能部分恢复OLZ诱导的线粒体碎片化并挽救细胞活力，却无法逆转胰岛素信号损伤、葡萄糖摄取障碍和线粒体膜电位下降，表明过度的线粒体分裂并不是OLZ致胰岛素抵抗的唯一原因。Mdivi-1单独抑制Akt/ERK磷酸化，可能与它作为线粒体复合物I抑制剂的效应有关。计算结果显示OLZ-H⁺确实能与DRP1催化口袋结合，且亲和力与Mdivi-1相当，但OLZ在实验中表现为促进分裂而非抑制分裂，说明这种口袋占据并不等于功能性GTPase抑制，其生物学活性更可能由OLZ多靶点药理学决定。此外，L6细胞中存在多种可调节葡萄糖代谢的G蛋白偶联受体通路，OLZ可能通过这些线粒体外机制损害胰岛素信号。

研究结论：本研究显示OLZ在L6成肌细胞中诱导线粒体碎片化、降低细胞活力并引起胰岛素抵抗，但Mdivi-1虽能挽救活力却不能恢复胰岛素敏感性和线粒体生物能学，表明OLZ诱导的胰岛素抵抗是由DRP1介导的分裂途径以外的通路所介导。分子对接虽然将OLZ置于DRP1 GTP结合口袋，且预测亲和力与已知DRP1抑制剂相当，但无法解释其促分裂和胰岛素脱敏表型。未来研究应聚焦于OLZ损害胰岛素信号通路的具体线粒体外机制，为需要SGA治疗的患者开发更好的联合治疗策略。