用于评估人诺如病毒抗体反应的人肠类器官中和实验的优化与微缩化

《Journal of Virological Methods》：Optimization and Miniaturization of a Human Intestinal Organoid Neutralization Assay for Evaluating Human Norovirus Antibody Responses

摘要要点：- 384孔HIO测定法用于检测针对GII.4悉尼HuNoV的中和抗体- 相比96孔测定法，微量化使血清用量减少4倍- 384孔与96孔中和抗体滴度呈高度一致性- 该测定法可检测到疫苗和感染诱导的中和反应- 384孔平台是迈向nAb检测的节省血清步骤引言人类诺如病毒是轮状病毒疫苗投入使用后全球急性病毒性胃肠炎的首要病因，给发达国家和发展中国家带来了巨大的医疗和经济负担。诺如病毒暴发影响所有年龄段人群，但在儿童、老年人和免疫功能低下人群中更常导致严重后果。其经济成本巨大，仅在美国每年的直接医疗费用、暴发管理和生产力损失就超过106亿美元。这些临床和公共卫生影响推动了预防诺如病毒相关疾病疫苗的开发和评估，以及保护性免疫相关性标志物的表征工作。自2012年出现以来，GII.4悉尼变异株一直是全球优势诺如病毒株，近年来绝大多数流行性和散发性胃肠炎病例均由其引起。GII.4变异株的长期流行被认为与其抗原性进化、高传染性和有效的免疫逃逸有关。该病毒变异株的持续存在凸显了对更好方法评估人群免疫力和评价疫苗免疫原性的需求。人类诺如病毒通过与肠道上皮细胞表面表达的血液组织群抗原相互作用而启动感染。HBGA作为细胞附着因子对感染启动至关重要，能够阻断HBGA-病毒相互作用的血清抗体升高与激发试验中症状性发病风险降低相关，也与现场有效性试验中（Takeda TAK-214, Hillevax HIL-214）结果相关。在可重复的人诺如病毒实验室培养系统建立之前，中和抗体的直接评估尚不可行，这限制了机制研究和疫苗开发。因此，HBGA阻断抗体滴度被用作保护性免疫的替代中和抗体指标。人类肠道类器官培养系统的开发彻底改变了诺如病毒研究。HIO培养物从肠道隐窝分离的干细胞建立，并作为连续培养物维持。这些三维体外培养物可增殖，并可分化为三维培养或解离为二维单层，后者便于顶膜面接触以实现高效的诺如病毒感染和复制。HIO中的病毒复制允许直接量化中和抗体反应，并促进了针对诺如病毒基因型中和测定法的开发，包括原型GI.1以及广泛流行的GII.2、GII.3、GII.4、GII.6和GII.17病毒。诺如病毒研究的关键技术进步之一是亲本和基因工程HIO细胞系的建立，如J4FUT2敲入细胞系，该细胞系表现出增强的易感性，可培养至少34种诺如病毒基因型。这些HIO模型已被用于检测自然感染和疫苗试验的血清样本，揭示了HIO测定法中测得的中和抗体滴度与替代性HBGA阻断抗体滴度之间的强相关性。中和病毒的直接测量是一种功能性测定，对于理解保护性相关标志物和疫苗诱导的免疫至关重要。尽管在96孔板中使用常规HIO基中和测定法取得了进展，但该测定法格式需要较大的样本量（每个滴度稀释需50μL血清），限制了涉及多组血清样本的诺如病毒疫苗或治疗评估研究的可扩展性。此外，96孔HIO中和测定法目前尚不可用于商业实验室，而HBGA阻断测定法是经验证的替代性中和测定法，已广泛用于评估诺如病毒免疫力和疫苗应答。为克服这些局限性，我们将针对全球优势GII.4悉尼株开发的HIO中和测定法微量化为384孔格式（每个滴度稀释12.5μL血清，减少4倍），并与此前96孔格式获得的结果进行了比较。这种节省血清的平台可能改善未来在商业检测实验室中实施可行性，并提供功能性读出，可与现有HBGA阻断测定法互补，同时保持与96孔格式的一致性（r=0.95），并能有效实现临床研究中血清学中和抗体终点的分析。研究人群与样本采集六份商业获取的参考血清（BioIVT，马里兰州巴尔的摩），涵盖广泛的HBGA阻断抗体滴度，被纳入初步分析。此外，还纳入了来自NOR-211试验的血清样本，该试验是一项评估双价HIL-214诺如病毒VLP疫苗的2b期现场试验，该疫苗由GI.1和GII.4c的VP1病毒衣壳蛋白组成——为Houston/2002、Yerseke/2006和Den Haag/2006b变异株之间的共识序列——在美国健康成人中开展。结果使用六份商业来源的参考血清，涵盖不同的HBGA阻断滴度范围，384孔HIO测定法测得的90%中和滴度与96孔测定法结果呈近线性一致（r=0.98，P<0.001；图2）。尽管两种格式显示出高度一致性，但一些样本在微量化格式中产生了较低的滴度，如其位于一致性线（y=x）下方所示。HIL-214和安慰剂受试者血清的中和数据：讨论微量化中和格式已被广泛采用，以提高通量、减少样本量并实现更复杂的研究设计。以往使用经典细胞系的试验表明，微量化微中和平台在保持相关性和重复性的同时，实现了自动化和大规模检测，适用于疫苗和抗体研究。例如，384孔寨卡病毒微中和测定法与蚀斑减少中和试验呈强相关性。结论我们开发了一种384孔HIO中和测定法，该法与常规96孔格式保持高度一致性，同时将细胞和培养基以及血清和病毒用量减少4倍。384孔平台的中和抗体滴度与96孔中和滴度和HBGA阻断滴度均呈强相关性，在参考血清以及在NOR-211试验中疫苗接种者和自然感染者的样本中均如此，支持其作为诺如病毒节省血清功能性测定法的实用性。伦理声明所有参与者或其法定代理人均已获得书面知情同意，同意参加本研究并发表文章。研究已遵守参与者的隐私权。本研究包括器官或组织捐献者。本研究包含人类生物材料，捐献者或其近亲或法定代理人已获得同意，同意将这些材料用于本研究及文章发表。本研究使用的样本并非来源于被处决的个体。CRediT作者贡献声明Ketki Patil：资源。Aaya Boussattach：资源。Sue E. Crawford：写作——审阅与编辑，方法论。Robert L. Atmar：写作——审阅与编辑，验证，方法论，形式化分析，概念化。Michael E. Abram：写作——审阅与编辑，资金获取，概念化。Astrid Borkowski：写作——审阅与编辑，验证，资源，概念化。Sasirekha Ramani：写作——审阅与编辑，方法论。Mary K. Estes：写作——审阅与编辑。利益冲突声明作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文中报告的工作。致谢我们感谢Dennis Faix对原临床研究开展的贡献，以及北卡罗来纳大学的Paul Brewer Jensen和Michael L Mallory对GII.2 HBGA阻断研究提供的帮助。资金支持本研究由Hillevax Inc.（美国波士顿）支持。